宿主-病原体蛋白质-蛋白质相互作用图谱的比较研究方法

以下实验的总体目标是进行异源互作研究，以比较不同病原体变异株的蛋白质与一组共同的细胞因子之间的相互作用特征。该目标通过基于酵母的cDNA文库双杂交筛选技术实现，用于鉴定来自不同病原体变异株的蛋白质的潜在相互作用伙伴。第二步，对鉴定出的相互作用伙伴的开放阅读框进行测序，并将其转入适用于进一步验证的载体中。

接下来，从所有双杂交筛选中获得的一组独立互作蛋白被选出，并重新检测其与所研究的全部菌株范围的相互作用。该检测采用一种基于哺乳动物细胞的正交GIA——荧光素酶蛋白片段互补实验，以提供可靠的比较性相互作用数据集。实验结果根据测得的荧光素酶活性，显示出病原体蛋白与宿主细胞蛋白之间不同的相互作用强度，从而提供了病原体-宿主蛋白相互作用的比较性概览。

通过层次聚类对相互作用谱进行分析，可将特定的宿主-病原体相互作用与病理特征相关联，并揭示病原体蛋白在致病过程中的作用。该方法相较于其他病原体-宿主蛋白相互作用图谱技术的主要优势在于，能够提供多个菌株变体之间严格的可比较相互作用数据集。该技术不仅有助于解析病原体蛋白的相互作用网络，还可应用于其他系统，例如利用完整病毒和病毒遗传学作为感染性分子进行研究。本实验方案的起始步骤为：按照书面协议所述，进行酵母细胞的接合与铺板。

30 毫升缺乏色氨酸的选择性缺陷培养基，其中含有转化了表达病原体蛋白的 P-G-B-K-T7 质粒的 AH109 酵母菌株，菌落数量较少。在 30°C 下振荡培养 30 小时。接下来，用 30 毫升的 AH109 菌液接种 200 毫升缺乏色氨酸的选择性缺陷培养基。

培养物在30摄氏度下旋转孵育20小时。同时，将转化了cDNA文库的Y 187菌株在20毫升YP培养基中于30摄氏度旋转孵育10分钟。随后，取相当于存活Y 187酵母细胞数量的PG BK T7转化AH 109培养物体积，在3,500 ×g、20摄氏度条件下离心5分钟。

小心吸去上清液，并将沉淀物在 10 毫升 YP 胶中重悬。将重悬的 AH109 酵母与含有文库的 Y187 混合。转移至 50 毫升离心管中，在 20 摄氏度下以 3,500 转/分钟离心 5 分钟。

小心吸除上清液后，将沉淀重悬于 YP 胶中，总体积为 1.5 毫升。接着，将酵母均匀涂布于三块 YCM 琼脂平板（直径 150 毫米），每板 0.5 毫升，并在 30°C 下孵育 4.5 小时。用玻璃刮刀从 YCM 平板上刮取交配后的酵母，收集至 10 毫升缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的选择性 dropout 培养基中。

用五毫升相同培养基洗涤平板两次，随后在 3,500 RPM 和 20 摄氏度条件下离心五分钟，收集菌体。弃去上清液并重复操作。将酵母沉淀重悬于五毫升缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的筛选性缺失培养基中。

然后将交配后的酵母均匀涂布于10个选择性缺陷型琼脂平板上，该平板缺少亮氨酸、色氨酸和组氨酸，并添加了在自激活试验中确定的适当浓度的3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）。在30°C、湿润环境中培养6至10天后，按照书面实验方案所述计算二倍体率。挑取酵母菌落，转移至新鲜制备的选择性缺陷型琼脂平板上，该平板缺少亮氨酸、色氨酸和组氨酸，但含有3-AT。

将酵母按8列12行的布局排列，模拟96孔板的结构，以便后续测序操作更加便捷。将酵母菌落在30摄氏度、湿润的环境中培养4至5天。本部分的目标是通过PCR扩增从在缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的选择性 dropout 琼脂平板上生长的酵母菌落中裂解释放出的PA ct2载体所含的cDNA。

首先将一个96孔PCR板置于冰上，每孔加入50 µL Xmal 20 T溶液以裂解酵母细胞。每孔轻轻重悬一个菌落。将PCR板在37 °C孵育15分钟，随后在95 °C孵育15分钟。

将培养板放回冰上后，每孔加入50微升蒸馏水，用移液器吹打混匀，随后在4摄氏度、3,500 RPM条件下离心5分钟。按照文字实验方案中的说明配制X tack混合液后，将40微升混合液分装至96孔PCR板的每孔中。每孔加入10微升裂解后的酵母溶液，并按照文字实验方案中列出的程序进行扩增反应。

取3 µL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，以检测PCR阳性克隆。对从这三个阳性克隆中分离出的PCR扩增片段进行测序。随后进行BLAST分析，以鉴定细胞开放阅读框，在细胞转染前剔除置信度低的比对结果以及含有移码和提前终止密码子的序列。

将病原体蛋白和细胞蛋白的开放阅读框分别转入相应的载体中，以生成与Gaussia荧光素酶片段融合的蛋白，具体操作详见文本方案。将293T细胞以每毫升DMEM培养基含10%胎牛血清（不含抗生素）且细胞密度为350,000个/毫升的条件接种，在无菌白色培养板中每孔分配100微升，于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养24小时。次日，采用任何合适的转染方案进行转染，每孔分别加入100纳克的病原体和宿主开放阅读框质粒，同时每孔转染10纳克的CMV萤火虫荧光素酶质粒，用于校正转染效率。

每个点均以三份重复的转染混合物转移至培养的293T细胞孔板中。由于293T细胞贴壁性较弱，容易从孔底脱落，因此加入DNA混合物时应轻柔操作。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育24至30小时。用PBS洗涤细胞，每孔加入100微升。每孔加入40微升1×裂解缓冲液，在室温下孵育30分钟。

在振荡条件下，另取10微升细胞裂解液置于白色酶标板中，用于后续的萤光素酶定量，样品可保存于4摄氏度，或短期保存于负20摄氏度，以检测Gaia活性。将酶标板放入化学发光检测仪中，向细胞裂解液中加入100微升香草醛萤光素酶检测试剂，随后计数发光信号10秒。

对一块96孔板进行剂量处理大约需要半小时。请始终使用新鲜提取物，因为冷冻或长期储存可能会影响剩余10微升细胞提取物中由相互作用介导的Gaia活性。使用化学发光仪将50微升萤火虫荧光素酶检测试剂注入细胞裂解物中，并计数发光信号10秒。

每种相互作用的96孔板剂量测定大约需要半小时。通过计算Gaia荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值，获得标准化的GAIA发光值，并考虑转染效率和细胞活力。

计算三个重复样本的平均值以监测相互作用。为每种病原体-宿主配对估算归一化的发光比值（NLR）。具体方法是：将检测到的、在同时存在病原体和宿主蛋白条件下的归一化GAIA发光活性，除以对照孔中测得的活性之和。

在之前的一项研究中，NLR 阳性相互作用的截断值估计约为 3.5。高通量 GIA 原理、蛋白质互补检测法（H-T-G-P-C-A）的主要优势在于其高灵敏度，这一点可通过评估 HPVE 两种蛋白的假阳性率和假阴性率来说明，以确定假阴性率。通过 H-T-G-P-C-A 检测了 HPV 16 E2 已知的相互作用，18 种相互作用中有 4 种未被检出，对应 22% 的假阴性率。

使用12种HPVE2蛋白与一组随机的细胞蛋白进行检测，假阳性相互作用的比例为5.8%。本图突出了该方法的高度特异性：一个已知会干扰E2蛋白与其细胞伴侣BRD4结合的单点突变完全消除了NLR比值。这种大规模比较性互作组学方法最近已成功应用于来源于不同基因型的人乳头瘤病毒三种早期蛋白E2、E6和E7，这些蛋白代表了各自早期蛋白在嗜性与病理学方面的自然多样性。

对相互作用谱进行层次聚类，大部分重现了HPV的系统发育关系，证明了该方法的稳健性以及相互作用数据集的广泛适用性。该方法可用于将特定的病毒-宿主相互作用谱与病理特征相关联，从而为病毒蛋白的参与提供线索。在致病机制研究中，可提取出基因型特异性的相互作用，这些相互作用可能对应于组织嗜性或致病相关的生物标志物。

如图所示，针对 E6 的六个相互作用伙伴，细胞靶点根据相互作用强度进行排序，并按相互作用的 HPV 类型分组。这种表示方法有助于识别特异性生物标志物，例如 fad，它仅与致癌型 HPV 的 E6 蛋白发生相互作用。此类靶向作用对于所有致癌型 HPV 的致癌特性至关重要，因此 fad 是作为 HPV 感染的替代标志物或治疗靶点的良好候选分子。

按照此方案，H-T-G-P-C-A 可以进行调整，用于与生物素标签融合表达的第三种蛋白质。这使得能够在链霉亲和素包被的彩色孔板上捕获三种相互作用的复合物，从而回答大分子蛋白质复合物形成的问题。

观看本视频后，您应能够充分理解如何表征病原体、宿主及其相互作用。首先，通过检测多种菌株变体的相互作用伙伴；其次，通过在哺乳动物细胞中利用蛋白质-蛋白质相互作用分析方法，比较它们与一系列不同类型病原体的相互作用。