一种高通量、高内涵、基于液体的 C. elegans 病理系统

该方法可用于解答宿主与病原体相互作用及药物发现领域的问题，例如不同毒力因子的重要性，以及小分子化合物在抑制发病过程中的作用能力。该技术的主要优势在于其以液体形式进行，且所需体积较小。首先，在生物安全二级（BSL 2）生物安全柜内操作，将铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）从冻存菌种划线接种至LB琼脂平板上。

将培养板在37摄氏度孵育16至24小时，然后将培养板在4摄氏度保存，最多可保存一周。在准备检测培养板前两天，从培养板上挑取单菌落，接种于3至5毫升无菌LB液体培养基中。在37摄氏度孵育培养物12至16小时。

根据文本方案配制慢杀灭（SK）培养基后，取350毫升来自新鲜过夜LB培养物的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），接种至每个10厘米的SK平板。使用无菌涂布棒将细菌均匀涂布，并将平板置于生物安全柜中晾干。

然后，将培养板在37摄氏度下孵育24小时。为了在24孔深孔板的单个孔中并行测试多种RNAi细菌菌株，从先前制备的含RNAi的细菌克隆中各挑取单个菌落，接种至4毫升添加了羧苄青霉素的LB培养基中。将培养板放入专为多孔板优化的摇床培养箱中，在37摄氏度、950 rpm条件下振荡培养16小时，随后在2,000 g离心5分钟收集细菌。通过将培养板倒置并用力振荡，弃去上清液。

用 100 微升 S 基础培养基重悬 RNAi 细菌。将重悬的细菌用移液器加入含有 IPTG 和羧苄青霉素的多孔 NGM 培养板的适当孔中，并让培养板干燥。根据文本方案制备 L1 期线虫后，通过移液将约 5,000 条线虫接种到每个 10 厘米的培养板上，每个培养板预先接种 RNAi 细菌或 OP50 超级食物，以准备基础实验。

进行RNAi筛选实验时，将约300条线虫移至接种了RNAi细菌的24孔板中，每孔加一条。若所用线虫品系在温度敏感条件下不育，则先在15摄氏度培养约16小时，随后转移至25摄氏度继续培养44小时，以完成发育并抑制胚胎形成。进行液体致死实验时，使用细胞刮从SK平板上刮下铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），并将其重悬于约5毫升S. Basal溶液中。

使用分光光度计测定细菌悬液在600 nm处的光密度（OD 600）。在S.Basal培养基中制备24毫升铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）稀释菌液，使其OD 600为0.9，然后加入21毫升液态SK培养基，使用多通道移液器将45微升菌液与培养基混合物转移至384孔板的每个孔中。将线虫从原培养体系中冲洗至50毫升锥形管中，并在重力作用下使其自然沉降。

吸去上清液至5毫升，然后总共使用50毫升S.Basal重悬线虫，并重复洗涤两次。根据文本方案，使用线虫分选仪将约22条线虫分选至384孔板的每个孔中，然后用透气膜密封培养板，在25°C下孵育24至48小时。在预定时间，使用微孔板洗涤仪和S.Basal对384孔板总共洗涤5次。

最容易犯的错误之一是在线虫完全沉降之前就吸取384孔板中的液体。准确判断线虫是否已完全沉降需要一定的经验。在最后一次洗涤后，将上清液吸除至剩余20 µL。

然后，每孔加入 50 微升 98 微摩尔的核酸染料，使终浓度为 0.7 微摩尔。将培养板在室温下孵育 12 至 16 小时。在完成所需的孵育时间后，使用酶标洗板机至少洗涤培养板三次。

使用分光光度计或自动化显微镜进行数据采集，以获取透射光和荧光图像。在含有300条线虫的24孔板的每个孔中加入1毫升S基础培养基。通过轻轻振荡培养板使线虫混匀，然后将线虫转移至一个空的、无菌的24深孔板中。

让线虫在重力作用下自然沉降，约五分钟。吸除上清液，每孔保留约一毫升。然后向每孔加入7毫升S基础培养液。重复洗涤两次，最后一次洗涤后，吸除上清液，仅保留约400微升。

为了避免细菌饥饿，将细菌移液至384孔板中，然后使用蠕虫分选仪的重取样功能，将22条蠕虫分选至每个384孔板的孔中。最后，在分选完成后，加入小分子或其他实验特异性材料。如本图所示，当按照本视频所述步骤操作时，仅在存在铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的情况下，才会观察到秀丽隐杆线虫（C.elegans）的时间依赖性死亡现象。

相比之下，若缺乏关键的细菌营养补充物，则几乎不会观察到杀灭作用。如图所示，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在37摄氏度孵育后转至25摄氏度孵育的两步法，对于传统的慢杀灭实验至关重要，最初在液体杀灭实验中被采用，但在本实验中并非必需。该方案可耐受较宽范围的初始细菌浓度，最低可至OD600等于0.025，仍能表现出时间和浓度依赖性的杀灭效果，尽管杀灭时间会有所偏移。

此外，通常仅需四个孔即可获得具有统计学意义的数据。当信噪比较高时，处理方法的实用性如本例所示：分析过程简单，且区分阳性与阴性条件轻而易举。在这些情况下，即使微弱的信号也能被轻易识别。

一旦掌握，该技术每块384孔板的操作时间约为60至75分钟（不包括分选时间）。在进行该操作时，必须注意将所有组分加入培养基中，否则毒力会受到影响。该检测方法简化了在宿主-病原体研究中将完整生物体表型筛选应用于药物发现的过程。

观看本视频后，您应能充分掌握如何开展基于液体的秀丽隐杆线虫（C. elegans）病原性测定实验。该实验流程可通过替换其他病原体（例如用粪肠球菌 E. Faecalis 替代铜绿假单胞菌 P. Aeruginosa）进行调整，从而有助于探索其他细菌感染的治疗方法。请务必注意，操作铜绿假单胞菌（P. Aeruginosa）或粪肠球菌（E. Faecalis）等感染性细菌可能存在危险。

进行此操作时，应始终采取适当的预防措施，例如接受正规培训、穿戴合适的个人防护装备以及采用正确的操作技术。