一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

秀丽隐杆线虫（C.elegans）的胚胎发育大约需要13小时，通常通过一次拍摄一个胚胎来进行监测。然而，我们的实验方案能够同时对80至100个胚胎进行三维时间序列成像。这种大规模采集发育中秀丽隐杆线虫胚胎数据的能力，为一系列新实验提供了可能，包括对发育事件的定量分析以及大规模筛选实验。

该方案可轻松调整，用于捕获不同的发育过程，或对在特定组织中表达任意标记物组合的胚胎进行成像。将胚胎均匀分散于孔中具有一定挑战性。胚胎应紧密排列，以便在单个视野中捕获多个胚胎，同时避免在不同Z平面发生聚集。

我们建议两名研究人员并排在冰上进行解剖，并封闭未使用的孔。我们还将演示一些快速设置分阶段384孔板的实用技巧。首先，使用PCR粘性封膜密封底部为玻璃的384孔板，以遮蔽未使用的孔。

使用剃刀或手术刀切去铝箔，暴露部分孔以便使用。向每孔中加入 70 µL 新鲜配制的 TMHC，并将板置于冰上。排除板的最外两行，以避免边缘效应。

为快速制备样品，建议两名研究人员并行进行解剖操作。当所有溶液接种完毕后，使用精细镊子和解剖显微镜，将约10条具有生殖力的成虫转移至每个条件对应的凹面载玻片中，其中含有150 µL冰冻的TMHC溶液。使用镊子和解剖刀解剖线虫以释放胚胎，并将拉制的毛细移液管装入口吸装置中。

使用口吸管将所有处于2至8细胞期的胚胎转移至已准备好的培养板的各个孔中，并检查培养板，确认各孔内无聚集物存在。当所有胚胎收集完毕后，通过离心使样本沉降，并使用经乙醇浸润的擦拭布清除培养板底部的任何残留物。将培养板放入配备有温度控制环境的共聚焦显微镜的板架中，使用10倍物镜对每个孔进行预扫描，以识别含有合适胚胎的视野。

扫描结束后，切换至60倍物镜，在每个时间点调整焦平面，对每孔成像1到4个视野，并以2微米为间隔在10小时内每隔20分钟采集18层Z轴切片。所有图像采集完成后，在过夜成像开始后约20至24小时进行一次低倍率的全孔明场扫描，以评估胚胎致死率。若要使用embryoCropUI可执行程序进行自动裁剪，请首先从Zenodo下载该程序及测试文件。

解压缩以确定该程序是否在平台上正常运行。下载完成后，解压并找到 embryoCropUI 可执行文件，双击启动程序。选择“打开”以加载第一个需要裁剪的特定 4D 视场。

当裁剪具有多个维度的TIFF序列时，仅在文件夹中加载该序列的第一幅图像。当所有图像加载完成后，设定成像参数，选择背景减除和衰减校正，并设置图像采集顺序及每像素对应的微米数。然后选择运行，系统将在未裁剪文件夹的同一路径下创建一个名为crop的新子文件夹，裁剪后的图像将保存在此位置。

为进行可视化操作，请从 Zenodo 下载开源且整合的 MSV2 ImageJ 插件及图形用户界面说明文件 Zenodorepov2.docx，并在 ImageJ 中打开该插件。找到第三行和第四行，输入图像文件夹在裁剪后将要存储的位置。

待处理条件的图像文件夹名称，以及每个过夜实验的唯一字母数字标识符。输入所有信息后，点击“运行”。此时将弹出一个窗口，提示导航至包含已裁剪图像文件夹的最外层文件夹。

选择后，将出现另一个窗口，可用于设定成像参数。点击确定。复合文件将开始组装。

当复合体生成后，检查仍处于打开状态的文件。当与定制报告基因品系联合成像时，可为大多数主要的发育事件提供具有信息性的读出结果，包括硫酸盐特化、背侧嵌合、表皮包裹、伸长以及神经发生。

注射后24小时是成像的最佳时间点。此时，母源蛋白已有效耗尽，合子基因表达也被有效抑制，从而在参与硫酸盐定型和形态发生的一系列基因中产生明显且高度可重复的特征性表型。在解剖和胚胎筛选步骤中务必保持耐心。

尽量减少团聚并选择合适焦平面对于确保高质量数据也至关重要。本方案可与多种荧光标记菌株联用，并可结合 RNAi 或突变体进行操作。我们的处理工具支持简化、自动化或手动的数据分析。

利用本文所述的菌株、方法和工具，我们的研究团队开展了一项基于RNA干扰的高内涵筛选，靶向约2,000个在胚胎发育过程中必需的基因。半高通量方法对于本项目的实施至关重要。