通过显微计算机断层扫描实现固定与染色后毫米级完整样本的刚性包埋，用于无切片三维组织学研究

该方法可使您从小型毫米级样本（包括小型模式生物）中生成三维组织学图像。该技术的主要优势在于，包埋后的样本非常稳定，可长期保存，并能进行多次成像，例如在多年内使用不同的成像方法反复观察。该方法的输出结果将对高通量模式系统表型组学、毒理学研究，甚至人类组织诊断具有重要价值。

初学者通常会遇到困难，因为样本相对较小，难以定位或操作。视觉演示至关重要，需要格外注意以避免损伤样本。对于幼年或成年斑马鱼，在固定前应至少禁食24小时，以减少肠道内容物的体积。

将预冷至4摄氏度的10%中性缓冲福尔马林（NBF）和2倍浓度的Tricaine-S置于冰上。用预冷的2倍浓度MS-222溶液将鱼水体积加倍，以实现快速且人道的安乐死。在鱼停止活动后60秒，即人道安乐死后，将鱼放入平底玻璃小瓶中，瓶中盛有预冷的10% NBF溶液，并在室温下固定过夜。

第二天，用 1x PBS（pH 7.4）将固定的鱼标本冲洗三次，每次 10 分钟。洗涤后，将样品浸入 35% 乙醇中，在室温下轻轻振荡孵育 20 分钟。然后用 50% 乙醇重复此步骤。

将样品在新配制的0.3%磷钨酸（PTA）溶液中于室温下轻轻振荡孵育过夜，以进行染色。第三天开始时，配制体积比为1:1的100%乙醇与LR White丙烯酸树脂混合液。将样品在70%乙醇中清洗三次，每次10分钟，随后将样品在室温下用90%乙醇轻轻振荡孵育30分钟。

在相同条件下重复孵育，但使用95%乙醇，然后用100%乙醇再重复两次。最后，将样品浸入等体积的乙醇与LR White丙烯酸树脂混合液中，于室温下轻轻振荡孵育过夜。第四天，从瓶中移除混合液，加入100% LR White树脂以完全浸没样品。

在室温下轻轻振荡孵育两小时。两小时后，将树脂更换为新鲜的100% LR White树脂，在室温下继续轻轻振荡孵育一小时。组装包埋装置时，使用直径比样品直径至少大0.1毫米的聚甲基丙烯酸甲酯（poly MI）管，并将其切割至30毫米的标准长度。

然后将P1000微量移液头连接到包埋适配器的白色末端，并将聚甲基丙烯酸亚乙酯（poly MI）导管插入其狭窄端。样品在100% LR白色树脂中孵育一小时后，将其转移至小型称量舟中，并完全浸入100% LR白色树脂中。将包埋装置的导管对准固定样品的宽端，或朝向头部，缓慢将样本移入导管中。

将样品置于管子中央，确保标本上下两端的管内均充满树脂。随后立即用油性软质雕塑粘土密封管子的开口端：先将一小块粘土压成约一毫米厚的薄片，并用食指和中指固定住管子，然后用拇指缓慢将粘土压紧在管口，去除多余的粘土。

从微管头部取下包埋装置。通过轻轻旋转将管子抽出。在用手指抵住密封端以防止黏土弹出的同时，将管子的未密封端缓慢推入黏土中，以封闭另一端。

将管子水平放置在试管架上，置于烘箱中于 65 摄氏度下使树脂聚合 24 小时。次日结束后，收集样品进行图像采集。成功包埋的斑马鱼幼鱼应无任何被困住的气泡。

如果在包埋过程中有空气残留，在聚合过程中若样品未水平放置，空气可能向样本移动，从而降低成像质量。本方案已成功用于多种模式生物的包埋，例如斑马鱼、果蝇、水蚤和小鼠胚胎。

通过微计算机断层扫描（micro-CT）对斑马鱼、水蚤和果蝇进行成像，获得重建的三维渲染图像，可证明包埋的成功。在所有扫描图像中，均可观察到样本外部的包埋树脂，但其并不干扰样本本身。这些标本可长期保存，并可用于多次成像实验，例如2011年成像的斑马鱼幼体即展示了此特性。

2013年再次进行了扫描。储存后解剖结构特征仍得以保存，如两次扫描中肌肉局部放大图像所示。此外，将沿分段线条的强度分布归一化至各自平均值后，显示两次扫描中的局部峰值在空间上相吻合。

两次扫描中选定区域的平均强度值除以背景平均值，用于计算信噪比，两次扫描之间的信噪比结果高度一致。在实施该方法时，需轻柔操作以避免样品损伤，并仔细操作以防止引入气泡。完成此步骤后，可进一步采用组织学或电子显微镜等其他方法，以研究蛋白质表达模式，或在二维层面实现对感兴趣区域的更高分辨率观察。

我们希望本出版物能帮助您掌握高分辨率组织显微CT的强大功能。