厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用
2026年3月27日
本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位 小鼠海马体中的分析。
我的研究重点是建立标准化的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程，以实现对小鼠海马体等厚组织的原位结构分析。现有方法在厚组织分析上缺乏可靠性，因此本方案整合了经过优化的步骤，以实现标准化分析。首先，在洁净的玻璃表面滴加10 µL的10%蔗糖溶液。
迅速从刚处死的小鼠中解剖出海马组织。使用锋利的剃须刀片，切取大小为0.5至1立方毫米的小块组织。用牙签或细刷将组织转移至高压冷冻载具内已准备好的铜支持透射电镜载网上。
使用2-甲基戊烷保持组织湿润，并调整其在网格上的位置，同时尽量减少机械应力以避免网格损伤。随后，用直径为3毫米的铜箔片覆盖组织和网格。为完成组装，将第二个高压冷冻载样器平整面朝下放置在上方，形成密封的华夫三明治结构。
检查冷冻参数，确保仪器无异常。从组织分离到冷冻的总时间不得超过90秒。取一个新的300目金网格，作为提取操作的最终接收网格。
在室温下，使用体视显微镜小心地将载网夹入兼容的冷冻聚焦离子束 AutoGrid 载网环中。然后将组装好的 AutoGrid 直接存放在保持约 40 摄氏度的干燥烘箱中，以在使用前尽量减少结霜。在持续浸入液氮的同时，小心地将玻璃态化的透射电镜载网从周围的华夫格组件中分离出来。
使用预冷的细头镊子，轻轻将两个高压冷冻载具分开。接着，在预冷的冷冻装载工作台上，于液氮保护下将分离的组织载网安装到第二个冷冻聚焦离子束 AutoGrid 圆环中。将两个 AutoGrid 装入冷冻转移 Shuttle 样品 holder 的指定插槽中。
将每个自动网格（AutoGrid）按铣削缺口朝外且垂直放置，以实现较低的铣削角度。在转移至聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）前，始终保持装载完毕的样品架浸没于液氮中或处于预冷却状态。使用样品杆将样品台装入仪器中。
将冷冻样品转移至显微镜后，先在低倍扫描电镜（SEM）下找到组织网格位置。随后以30毫安电流对网格表面溅射镀铂15秒，以提供导电保护。再使用气体注入系统沉积一层厚度为0.5至1.0微米的有机金属铂帽，持续约60秒。
以30毫安电流对载网表面进行最终的溅射镀铂处理，持续15秒。利用扫描电镜（SEM）电子束成像，导航至组织载网上的目标区域。为进行正面铣削，将样品台调整至约110度旋转和7度倾斜，使样品表面呈适合离子束加工的角度。
进行沟槽铣削时，使用30千伏电压下的离子束定义一个围绕目标组织块的矩形沟槽。从距离组织块一定位置处开始铣削，采用15纳安的相对较高电流，以实现快速去除材料。当沟槽侧壁接近组织块至几微米范围内时，将离子束电流降低至7纳安，以获得更精确的铣削控制。
保留一侧的样品块与主体材料相连，以形成临时固定标签。对于估计厚度超过 20 微米的组织块，需从背面进行 undercut 铣削步骤，以利于最终的提取。旋转样品台并调整倾角，以便接触样品块的底部。
使用聚焦离子束在30千伏和3纳安电流下铣削底部连接面。铣削金属块的底部，使其与样品块紧密贴合。精密铣削样品与金块之间的接触面，以使接触更加紧密。
将样品与探针连接时，确保金块与目标样品直接接触。使用聚焦离子束在30千伏和0.5纳安条件下，在界面处进行8至12次连续的横截面铣削图案，以将金块焊接至样品。为取出组织块，使用聚焦离子束切断连接该块与主体样品的剩余连接部分。
小心操作显微操作针，将分离的组织块完全提起，使其脱离沟槽及周围网格。收回操作针，将组织块转移至接收网格。将显微操作针移至预先冷却的300目金质接收网格。
将组织块放置在选定的网格方格上。铣去网格上的微小冰晶，使组织块与网格更紧密地贴合。降低组织块，使其刚好接触网格。
使用离子束将块状样品上3至4微米厚的切片铣削至载网膜上。接着，通过在连接处两侧采用清洁截面模式进行铣削，牢固地焊接该切片，并如前所述重新在载网表面施加导电层和保护涂层。进行薄片减薄时，在设定好样品台倾角后，应在组织块的平整区域内确定薄片的最终位置。
根据所提供的表格中指定的离子束电流和过倾补偿，进行系统性铣削。当接近薄片约1至2微米时，可选择在距离薄片约1.5微米处铣削一条应力释放槽，以防止薄片弯曲或卷曲。完成薄片制备后，使用冷冻电子显微镜采集图像。
采用高压冷冻华夫法处理的组织块呈现出均匀且透射电子良好的外观。重建的断层图像清晰解析了细胞环境中的线粒体结构。细胞质中的大分子复合物（如核糖体）也得以清晰分辨。
在重建的断层图像中，也可观察到细胞骨架和膜相关的细胞特征以及核孔复合体。突触结构及特征，包括钙储存结构和髓鞘结构，在断层图像中清晰可见。该方案使研究人员能够在复杂的组织环境中直接研究细胞天然的外层结构。
本冷冻电子断层扫描实验方案中最关键的挑战是实现厚组织样本均匀且无伪影的玻璃化冷冻。按照本方案操作后，研究人员可利用相关光镜与电镜技术或标记技术定位感兴趣区域，进而进行亚断层平均化及结构分析，以解析大分子复合物的结构。
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概述
本文介绍了一种针对厚组织样本（以小鼠海马体为例）的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）综合性标准化工作流程。该方案结合了快速高压冷冻、精确的冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）切削，以及先进的成像和数据处理步骤，从而实现对复杂组织中天然细胞环境的高分辨率原位结构分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 冷冻电子显微镜
- 组织超微结构分析
背景
- 冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET）可实现细胞超微结构在接近天然状态下的三维可视化。
- 由于玻璃化和薄片制备方面的技术挑战，该技术在厚组织样本中的应用受到限制。
- 现有实验方案在复杂组织样本上的可重复性和通量往往不足。
- 亟需建立可靠的实验流程，以实现对组织内大分子复合物的原位分析。
研究目的
- 建立一种可重复的、适用于厚组织样本的端到端冷冻电子断层扫描工作流程。
- 优化玻璃化冷冻和薄片制备，以实现高质量成像。
- 实现对天然组织环境的高通量、无伪影结构分析。
使用的方法
- 使用带铜箔的“华夫格”组件进行组织的快速解剖和高压冷冻（HPF）。
- 将组织转移并装载到透射电镜（TEM）载网上，确保在解剖后90秒内完成玻璃化冷冻。
- 利用冷冻聚焦离子束（Cryo-FIB）铣削技术对组织块进行切取和减薄，获得厚度为120–200 nm的薄片，并采用过倾角补偿和应力释放沟槽技术。
- 采用溅射铂和气体注入系统（GIS）铂帽进行标准化导电镀层。
- 使用 PACEtomo 脚本实现自动化、剂量对称的倾转系列图像采集。
- 利用 AreTomo 3 进行数据处理，包括运动校正、CTF 估计、图像对齐和加权反投影（WBP）重构；可选 IsoNet 进行缺失楔形校正。
- 使用 RELION 4.0 进行子断层平均化及分辨率评估。
主要结果
- 该流程可稳定制备出良好玻璃化、均匀的薄片（目标厚度为 150 ± 40 nm）。
- 可实现高通量的倾转系列图像采集（每个倾转系列通常耗时 5–8 分钟）。
- 重建的断层图像能够分辨关键的细胞结构，包括线粒体、核糖体、细胞骨架组分、核孔复合体、突触特征、钙储存结构以及髓鞘。
- 该方案可实现对厚组织样本中大分子复合物的原位直接可视化与分析。
结论
- 该标准化方案克服了厚组织冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中的主要挑战，特别是玻璃化冷冻和薄片制备。
- 它为在复杂组织环境中开展原位结构生物学研究提供了可重复、高通量的技术路径。
- 该工作流程支持直接从组织样本中对天然细胞结构和大分子复合物进行详细分析。
常见问题
行业重要性概述
对厚组织样本进行高分辨率的原位结构分析是早期发现与转化研究中的关键瓶颈。本标准化的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程可实现对复杂组织中天然细胞结构的可重复、最小化伪影的可视化，有助于提高靶点验证和机制研究去风险化过程中的预测可信度。该方案具备高通量与高可靠性，可作为企业级规模的结构生物学研究和临床前模型开发的基础性技术平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在天然组织环境中直接研究大分子复合物。
- 通过解析与疾病通路相关的细胞超微结构，支持机制层面的风险评估。
- 通过高保真可视化亚细胞特征，促进功能靶点的验证。
- 通过最大限度减少样品制备过程中的人工假象，提高对项目筛选的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 制备适用于高通量成像工作流程的均匀、电子透明薄片。
- 标准化样品制备流程，确保不同实验间具有可重复性和定量可比性。
- 支持在筛选实验中对化合物对组织超微结构的影响进行可靠评估。
- 支持平台的可扩展性和多种组织类型的重复使用，仅需极少调整。
转化与临床前研究
- 将结构读数与疾病相关的组织模型相整合，推动转化生物标志物的发现。
- 实现从发现阶段的机制性认知到复杂组织中临床前验证的连续性。
- 通过早期检测超微结构表型，降低后期生物学失败的风险。
- 基于对靶点结合的直接可视化，支持经风险评估调整的推进决策。
流程与工作流整合
该工作流程通过实现对厚组织的稳健、高通量结构分析，连接了早期发现、先导物识别和临床前研究。
- 发现生物学：通过直接可视化天然大分子复合物，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的薄片制备方法，确保下游成像与分析的可靠性。
- 分析：提供高分辨率断层图和子断层平均图，用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究：利用原位组织结构，促进生物标志物定位及与疾病相关模型的验证。
- 企业级复用：建立可扩展、标准化的实验流程，适用于多种组织类型和研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的样品制备与成像工作流程。
- 战略价值：通过降低后期生物学风险，实现更优的立项/终止决策和资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于结构验证的靶点进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备冷冻电镜（cryo-EM）、冷冻聚焦离子束切片（cryo-FIB milling）和高压冷冻仪器操作的专业技术。
- 需要能够使用先进的分析基础设施，以实现自动化倾转系列图像采集和数据处理。
- 需要跨团队统一标准化样品处理、玻璃化冷冻及薄片制备的操作流程。
- 若推广至其他组织类型，可能需要优化解剖方法和冷冻参数。
- 实现均匀的玻璃化冷冻并最小化人为假象，对于获得可重复且高质量的结果至关重要。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
High-Pressure Freezing of Thick Tissue for Cryo-Electron Tomography
1:44
Preparation of Receiver and Tissue Grids for Cryo-FIB Lift-Out
4:08
Tissue Block Isolation and Lift-Out
6:56
Block Attachment to the Receiver Grid
7:49
Lamella Thinning
8:36
Results
9:23
Conclusion
