利用扫描电子显微镜和整体免疫荧光技术在原肠形成期小鼠胚胎中观察脊索中胚层与脊索板

脊索中胚层节点和脊索板在小鼠胚胎发育过程中是至关重要的组织中心。今天，我们将介绍发育生物学研究者用于观察和研究这些结构的两种技术。在第一个实验方案中，我们将演示如何进行扫描电子显微镜（SEM）操作；在第二个方案中，则介绍整体免疫荧光染色技术。

在胚胎发育第7.75天（E7.75），脊索中胚层节点（node）和脊索板（notochordal plate）短暂地出现在胚胎表面，其上突出的微小纤毛可向外延伸，从而可通过扫描电镜（SEM）进行识别与观察。在以下两个实验方案中，我们将演示处理相对微小的小鼠胚胎的关键步骤，并重点介绍如何转移和操作这些胚胎。首先，通过皮肤和肠系膜切开已处死的妊娠小鼠的腹腔。

使用剪刀和精细镊子取出子宫。将子宫在蒸馏水中短暂冲洗，然后放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的小培养皿中。接着，在解剖显微镜下使用精细镊子去除子宫肌肉组织，以分离出各个蜕膜。

在解剖显微镜下，用一对镊子夹住每一块蜕膜，用另一对镊子在红色部分与白色部分之间沿纵轴做全层切口。沿着蜕膜的白色部分，紧接切口处垂直进行浅表穿孔。然后将蜕膜沿水平方向轻轻撕开成两半，并从蜕膜的白色部分小心取出胚胎。

此后，将胚胎转移至含有无菌过滤 PBS 的新培养皿中。从卵黄囊锥开始，去除每个胚胎的Reichert膜。为后续基因分型，取一小块卵黄囊组织。

在化学通风橱下，将胚胎转移至含有电子显微镜级固定液的微量离心管中，该固定液由2.5%戊二醛和无菌过滤的PBS组成。随后，在不扰动胚胎的情况下，从管中移除固定液。用无菌过滤的PBS在室温下洗涤胚胎三次，每次15分钟。

将胚胎依次置于50%、70%和85%的乙醇（以PBS稀释）中进行脱水，每个浓度处理5分钟。随后用100%乙醇洗涤三次。将胚胎保存在100%乙醇中，置于20°C条件下，或直接进行下一步操作。

此后，将胚胎转移至适当的容器中，并去除残留液体。向胚胎中加入等体积的六甲基二硅胺烷（HMDS）和乙醇，处理30分钟。然后，移除液体，再加入纯HMDS处理30分钟。

用移液器吸除胚胎中的液体，静置干燥30分钟。使用小毛刷和双面胶带将干燥的胚胎腹面朝上固定在扫描电镜样品台（SEM stubs）上。将样品台放入溅射镀膜仪中进行金颗粒镀膜。

扫描电镜样品制备中最精细的步骤之一是将胚胎以正确的方向固定在样品台上。一旦胚胎接触到导电胶带，其方向便无法再调整。此后，将镀膜后的样品台放入扫描电镜中，施加真空，观察胚胎节点及脊索板细胞上的纤毛。

在 E7.75 时期取出胚胎后，将其置于含有 PBS Tween 的培养皿中，并放在冰上。在化学通风橱内，将胚胎转移至含有固定液的微量离心管中。随后，小心移除管中的固定液，注意不要触碰胚胎。

然后，在含有0.2%Triton X-100的PBS中，于室温下在旋转摇床上孵育胚胎，每次5分钟，共洗涤三次。移除最后一次洗涤液，并加入封闭液（含PBS-Triton和10%热灭活血清）。在4°C的旋转仪上封闭胚胎至少两小时。

接着，去除封闭液，加入约一毫升用封闭液稀释的一抗。将胚胎在4°C的摇床中孵育过夜。移除一抗并保存，以备后续使用。

然后，用 PBS-Triton 溶液将胚胎冲洗两次，并在摇床上以 30 分钟为一次，共洗涤三次。弃去洗涤液，加入针对一抗宿主物种的稀释荧光标记二抗进行孵育。

然后在4°C的摇床上孵育过夜。接着去除二抗，用含吐温的PBS缓冲液冲洗胚胎两次，再用含吐温的PBS缓冲液洗涤三次，每次30分钟。

用含有稀释的荧光偶联鬼笔环肽和稀释的DAPI的PBS Triton替换最后一次洗涤液，在室温下染色1小时。然后用PBS Triton将胚胎漂洗两次，并在室温下用PBS Triton洗涤30分钟。

此后，用 PBS 替代 PBS-Triton，将胚胎置于冰上。然后准备干净的带正电荷的载玻片、盖玻片以及基于水性甘油的封片介质。在载玻片上放置两条透明胶带，彼此间隔 15 毫米。

然后，在解剖显微镜下，使用改良的 P200 移液器将胚胎转移至载玻片上。用精细镊子在卵黄囊的两侧各做两个完整的切口，以展开胚胎。随后，将胚胎腹侧朝上放置。

向胚胎中加入 50 微升封片剂。然后，在盖玻片上加一滴封片剂。将其置于两条胶带之间，用弯头针缓慢地将盖玻片放下，覆盖在胚胎上。

使用吸水纸小心擦去多余的封片剂，注意不要移动盖玻片。然后，用足量的指甲油密封盖玻片的四周。最后，使用扫描共聚焦显微镜观察胚胎。

封片后切勿移动盖玻片，因为这会影响胚胎的三维观察效果。利用扫描电子显微镜观察了野生型和strip1突变型小鼠胚胎在E7.75时期的节点形成情况。与野生型中凹坑状的节点不同，突变型胚胎表现出扁平且规则的节点及节点索中胚层板结构。

现采用免疫荧光技术在细胞水平上研究 Strip1 突变胚胎中脊索孔和脊索板形成缺陷。数据显示，突变胚胎中的脊索孔和脊索板结构异常且发育迟缓。脊索孔和脊索板仅在胚胎表面短暂存在，因此扫描电镜（SEM）操作的时机至关重要。

例如，具有成熟结节和较长纤毛的胚胎（2到4个体节）适用于扫描电镜分析。试剂的纯度对于这些技术的成功也至关重要，尤其是在利用扫描电镜观察超微结构时。附着在胚胎上的微小杂质通常会导致严重的伪影。

我们认为，这两种技术在正常发育过程中以及在这些结构形成存在缺陷的突变体中，能够提供有关结节及结节皮质板结构的互补信息。