细胞周期分析在 秀丽隐杆线虫 使用胸苷类似物EdU标记生殖系

该方法有助于解答有关秀丽隐杆线虫（C.elegans）细胞周期和生殖系干细胞群体动态的关键问题。该技术的主要优势在于无需使用转基因，可与免疫荧光染色兼容，并且能够经过修改以研究多种不同条件下细胞的状态。当我首次看到Scheda实验室应用该方法时，感到非常兴奋。

尽管该方法可为秀丽隐杆线虫（C.elegans）的细胞周期提供研究线索，也可应用于有关衰老、营养或基因型改变的更广泛问题。通常，初次使用该方法的实验室可能在初期的个体分离或秀丽隐杆线虫苏木精染色步骤中遇到困难。首先，采用无菌技术，将200微升10毫摩尔的EdU加入含100毫升M9缓冲液及适当补充物的4毫升新鲜培养过夜的MG 1693大肠杆菌（E.coli）培养物中。

制备idiodiscious需要在EdU和胸腺嘧啶补充之间保持精细的平衡。胸腺嘧啶的量必须足以支持大肠杆菌良好生长，而EdU的量则必须足以提供对水平化作用的强效保护。在37°C、200 RPM条件下培养不超过24小时后，采用无菌操作技术将培养物分装至两到四个无菌的50毫升锥形管中，用于离心。

用4毫升新鲜M9缓冲液重悬沉淀，并使用同一支移液器将约8滴EdU标记的E. coli MG1693溶液加至室温下的60毫升M9琼脂培养皿中央。为将EdU标记的细菌喂食给线虫，使用新鲜PBS将C. elegans从线虫生长培养基培养皿中冲洗至1.5毫升离心管中，并通过重力让线虫短暂沉降。用1毫升PBS洗涤线虫1至2次，并使用玻璃巴斯德移液器将线虫转移至EdU细菌草坪中央，以微量PBS液滴承载。

等待几分钟，待液体被吸收后，根据实验方案在20摄氏度条件下孵育培养物至少30分钟。孵育结束后，使用两毫升PBS将EdU培养板中的线虫冲洗至玻璃解剖皿中。按照先前所述方法解剖并固定线虫性腺后，用添加0.1%吐温20的PBS冲洗一个小型1毫升硼硅酸盐玻璃管和一支长玻璃巴斯德吸管，并用该吸管将固定后的性腺转移至玻璃管中，加入少量含吐温20的PBS。

通过离心收集性腺，并使用细长的玻璃巴氏吸管尽可能吸除上清液，注意不要扰动性腺沉淀。进行EdU检测时，向性腺中加入100 µL的点击化学EdU反应混合液，用实验室封口膜覆盖管口，在室温下孵育30至60分钟。孵育结束后，先用100 µL反应清洗缓冲液洗涤性腺一次，再用1 mL含吐温的PBS缓冲液洗涤四次。

最后一次洗涤后，向样品中加入 25 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。在封片剂覆盖性腺的同时，将一个较大的 2.5% 琼脂糖垫放置在标准玻璃载玻片上，然后用另一张载玻片压平。

接下来，使用一根长玻璃巴斯德吸管，将所有液体和性腺保留在吸管狭窄的尖端，以在将性腺转移至琼脂糖垫时尽量减少样品损失。用一根粘在牙签上的睫毛轻轻将性腺在琼脂糖垫上分散开，并去除任何灰尘颗粒。然后缓慢地将一块矩形玻璃盖玻片盖在性腺上，注意避免产生气泡，并用实验用纸巾吸除多余的溶液。

可靠地进行三维细胞计数需要一定的练习。使用 Fiji 的细胞计数插件并结合脚本标记细胞，以去除重复计数，有助于提高计数的可重复性。在盖玻片静置过夜后，利用细胞计数插件和 Fiji 手动计数每个细胞核，并根据是否存在磷酸化组蛋白 H3、EdU 或前体区细胞标记，对每个单独的细胞核进行标注。

EdU信号与DAPI信号共定位。在某些细胞核中，EdU信号覆盖所有染色体，而在另一些细胞核中，EdU信号定位于一至两个明亮的点状区域，可能位于S期晚期复制的X染色体上。成功进行30分钟标记后，EdU信号出现在前体区约一半的细胞核中。

尽管该技术在野生型年轻成虫中效果稳定，但大量交配后的5日龄雌雄同体在30分钟的EdU脉冲标记中未能成功标记。通过分析在时间过程中处于M期且EdU阳性的细胞核所占百分比，可估算G2期的持续时间，从而计算出G2期的中位数和最长时间。根据前生殖区所有细胞核中EdU阳性细胞核所占的百分比，可估算G2期和G1期的持续时间，进而计算这两个时期合并后的最长时间。在进行该操作时，需注意使用同一批制备的EdU培养皿，以尽量减少实验间的变异性。

完成此操作后，可进行其他方法，如使用额外抗体染色，或解答有关细胞周期、细胞命运或信号通路的其他问题。请注意，使用核苷类似物和多聚甲醛可能存在危险，操作时应始终采取预防措施，例如佩戴腈类手套。