计算分析 秀丽隐杆线虫 生殖系中细胞核、蛋白质及细胞骨架分布的研究

本方法的总体目标是实现对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）生殖系的自动化分析，以研究其细胞核、蛋白质及细胞骨架的分布情况。该方法有助于解答秀丽隐杆线虫研究领域中的关键问题，例如细胞核和精子的数量、细胞核的分布模式以及生殖系的细胞骨架结构。该技术的主要优势在于能够缩短分析时间、增加样本量，并消除人工分析过程中可能引入的人为误差。

为了成像样品，将带有染色生殖系的载玻片放入共聚焦显微镜63倍物镜上方的载物台中，找到生殖系。聚焦于生殖系的顶部，并使用共聚焦显微镜软件标记该位置。确定生殖系的总厚度后，设定每个光学切片的厚度不超过0.5微米，并标记完整的生殖系范围。

然后开始采集，对每张切片扫描八次并取平均值，以提高图像质量。当所有图像采集完毕后，将图像导入合适的图像分析软件，使用表面功能工具选择有丝分裂区域。此时将显示生殖腺远端末端的图像。

取消自动表面创建向导，手动在三维图像堆栈的第一层和最后一层中围绕有丝分裂区域绘制感兴趣区域。单击“创建表面”，然后选择“遮罩通道”，以遮蔽除DAPI通道外的所有通道。使用斑点功能工具，将有丝分裂区域的大小参数定义为XY方向直径2微米，Z方向直径未定义。

单击“减去背景”以减去背景信号。为确定最小阈值，在DAPI染色的野生型生殖腺中逐步提高三维渲染的最小阈值，直至生殖腺外首次出现信号点，随后为每个区域生成三维模型。保存图像后，单击“表格”查看软件自动统计的细胞核数量，并将图像导出为TIFF文件。

对于过渡区，按之前所述方法创建表面。然后，点击“掩膜通道”以屏蔽除 DAPI 通道外的所有通道。使用点状功能，设定 XY 直径为 2 微米，Z 直径为 1.5 微米，并点击“减去背景”以去除背景信号。

为了确定最小阈值，逐步提高经DAPI染色的野生型生殖腺三维渲染的最小阈值，直至在生殖腺外首次出现信号点，并为每个区域生成三维模型。保存图像后，点击表格以查看软件自动统计的细胞核数量，并将图像导出为TIFF文件。在计数精子数量时，选择受精囊作为感兴趣区域（参照细胞核区域的设定方法），并使用“点”工具，将XY方向的直径设定为0.75至1微米，Z方向直径不作限定，以识别每一个精子。

选中“背景减除”框，并使用软件计算出的背景校正值进行背景扣除。然后，调整三维渲染阈值，以检测储精囊中所有经DAPI染色的精子。对于卵母细胞中的染色体计数，选择卵母细胞并将XY直径定义为小于0.75微米，在构建三维模型前设定阈值。

然后，将图像另存为 TIFF 文件以供导出。进行细胞骨架生殖系重建时，需在生殖系中确定有丝分裂的目标区域，并如前所述创建表面掩膜。点击“掩膜通道”以屏蔽除鬼笔环肽通道外的所有通道，然后使用表面功能工具定义 0.25 微米的表面细节。

扣除背景后，调整三维渲染阈值，以保存生成的三维图像并导出为 TIFF 文件。细胞核的分布依赖于分化阶段。例如，在有丝分裂区域，内层肌动蛋白呈现为实心团块，细胞核有序排列于其上。

在野生型生殖系中，有丝分裂区域包含约250个细胞核，与生殖系其余部分相比，细胞核排列非常紧密。然而，当细胞核逐渐远离远端时，它们开始更靠近生殖系的周缘分布，这种分布变化始于过渡区，并在细胞核进入减数分裂前期的第三阶段时完成。在过渡区，生殖系内部的肌动蛋白呈现出更明显的圆柱形结构，并在到达粗线期时形成中空的圆柱结构。

第二层肌动蛋白覆盖在内层之上，赋予生殖系特定形态。这种“筒中筒”结构的肌动蛋白在靠近卵细胞区域时逐渐消失，此时肌动蛋白呈现为覆盖在卵细胞表面的粗大纤维。在受精囊中，肌动蛋白也形成粗大的纤维束，但这些纤维的排列比卵细胞区域更为紧密。

如图所示，对生殖系近端进行三维重建，显示每个受精囊中平均有151个精子。一旦掌握该技术，每条生殖系的分析可在10分钟内完成。在进行该操作时，需注意根据实验中用于观察生殖系的物镜放大倍数，相应地设定分析参数。

观看本视频后，您应能够充分理解如何对生殖系进行自动分析，如何研究细胞骨架结构，以及如何对生殖系内的细胞核数量进行计数。