分离具有生理活性的类囊体及其在依赖能量的蛋白质转运实验中的应用

该方法有助于解答有关蛋白质跨叶绿体膜运输的机制与能量学，以及蛋白质在质体内的定位等关键问题。该技术用于类囊体蛋白靶向的主要优势在于，可在运输过程中完全控制类囊体的环境条件，包括温度、pH、离子条件和前体蛋白浓度。首先，将约55克豌豆浸泡于400毫升蒸馏水中，持续三小时。

将浸泡过的豌豆播种于塑料托盘中的土壤内，表面覆盖一层薄薄的蛭石，按照文本方案所述培养9至15天。在分离叶绿体当天，制备连续密度梯度：取15毫升Percoll与15毫升2xGB缓冲液混合，于15毫升聚碳酸酯高速离心管中，在4°C条件下，使用固定角转子以30,900 ×g离心30分钟（关闭刹车）。随后收获约25克培养9至15天的豌豆幼苗。

将它们加入装有95毫升预冷的1xGB缓冲液的冷藏搅拌器中，搅拌器刀片需锋利。然后进行匀浆。将此混合物通过置于漏斗上、覆盖至少两层纱布的冷藏烧杯过滤。

将滤液加入15毫升聚碳酸酯离心管中，使用水平转子在4°C条件下以3,000 ×g离心5分钟。弃去上清液，用毛笔轻轻将沉淀重悬于1毫升1×GB溶液中。随后，用玻璃巴斯德移液管小心地将筛分悬液铺加在Percoll梯度液的上层。

在4°C条件下，使用水平转子以8,000 ×g离心10分钟，离心时关闭刹车。再次使用移液器小心地将含有完整叶绿体的下层绿色条带转移至一个新的50毫升聚碳酸酯离心管中，并加入30毫升1×IB缓冲液。将离心管在水平转子中以1,800 ×g于4°C离心5分钟。

弃去上清液后，用毛笔将沉淀物轻轻重悬于1毫升1xIB溶液中。用30毫升1xIB溶液洗涤，并在相同条件下再次离心。最后一次离心后，将沉淀物重悬于1毫升1xIB溶液中。

为测定叶绿素浓度，将10微升完全重悬的叶绿体与5毫升80%丙酮混合。使用厚度为180微米、孔径为11微米的滤纸过滤，然后通过分光光度计测定叶绿素浓度。用预冷的1×IB缓冲液将叶绿体混合物稀释至每毫升含1毫克叶绿素。

当无需制备基质提取物时（例如进行叶绿体Tat转运实验），可开始分离类囊体。将完整叶绿体分装于1.5毫升离心管中，在4°C条件下，使用水平转子以1,000 ×g离心6分钟。随后弃去上清液，用低渗裂解缓冲液重悬沉淀物，使用微量移液器调节浓度至1毫克/毫升。冰上避光孵育10分钟，期间偶尔轻轻混匀。

为回收类囊体，将样品在摆动转子离心机中于 4 °C、3,200 ×g 条件下离心 8 分钟。通过将沉淀物用 1 至 2 毫升裂解缓冲液重新悬浮，然后在相同条件下再次离心，洗涤类囊体两次。最后一次离心后，将沉淀物重新悬浮于 1 毫升 1×IB 缓冲液中，并使用分光光度计按照此前所示方法测定分离类囊体中的叶绿素浓度。

对于需要回收基质提取物的途径，如CPSec1和CPSRP，将分离的叶绿体在摆桶转子中以600微升体积于4°C、1,000 ×g条件下离心6分钟。为裂解叶绿体，我们用600微升低渗裂解缓冲液重悬沉淀。在冰上避光孵育10分钟，期间偶尔混匀。

然后在4°C条件下，使用水平转子以3,200 ×g离心8分钟。为保留基质，将浅绿色至黄色的上清液转移至新的微量离心管中，并加入等体积的2×粗制基质缓冲液。为洗涤类囊体，加入两倍体积的裂解缓冲液，并在4°C条件下以3,200 ×g离心8分钟。

将沉淀重悬于1×IB中，使叶绿素浓度达到1毫克/毫升，并置于冰上备用，用于后续转运实验。通过在4°C下以42,000 ×g离心30分钟，使用固定角转子去除粗制基质中的残留膜成分。然后从每根离心管中收集95%的上清液体积，注意避免扰动底部少量黄绿色沉淀，同时记录每管中取出的体积。

为制备浓缩的基质提取物，汇集收集的上清液。然后使用4毫升、截留分子量为30千道尔顿的浓缩管将提取物浓缩至原体积的五分之一。在冰上，于1.5毫升离心管中进行cpTat转运测定：将分离的类囊体与最终浓度为0.33毫克/毫升的叶绿素、在1×IB中配制的5毫摩尔ATP以及在1×IB中配制的8毫摩尔DTT混合。

为启动转运，将底物蛋白加入转运反应混合物中。在室温下，用80至100微爱因斯坦每平方米每秒的光合有效辐射照射悬浮液10分钟，以进行反应。为终止转运反应，用预冷的1×IB缓冲液将悬浮液稀释至原体积的八倍。

在4°C条件下，使用微量离心机以3,200 ×g离心五分钟，以收集类囊体。弃去上清液后，将沉淀物重悬于120 µL预冷的1×IB缓冲液中。为检测CPSec1或PSRP通路，于冰上在1.5 mL离心管中混合以下组分。

将类囊体调整至叶绿素终浓度为0.33毫克/毫升，加入含0.83毫克/毫升叶绿素当量的基质提取物，以及在1xIB中配制的5毫摩尔ATP。用预冷的1xIB将反应体系补至所需体积，冰上孵育10分钟。通过向该转运混合物中加入体积分数为10%的底物蛋白，启动转运反应。

在室温下，使用80至100微爱因斯坦每平方米每秒的光合有效辐射照射10分钟。为终止反应，用预冷的1×IB缓冲液将悬浮液稀释至原体积的8倍。在4摄氏度下，于微量离心机中以3,200×g离心5分钟。

弃去上清液后，将沉淀重悬于120微升预冷的1×IB缓冲液中。为去除未被转运的残留底物，向其中加入6微升浓度为2毫克/毫升的嗜热菌蛋白酶以及10毫摩尔/升氯化钙（溶于1×IB缓冲液），以消化胞外蛋白。将蛋白酶反应体系置于冰上孵育40分钟。

通过加入等体积的含25毫摩尔EDTA的1xIB缓冲液终止蛋白酶反应。在4摄氏度下，以3,200 ×g在微量离心机中离心5分钟，以收集类囊体。去除上清液后，将收集的类囊体重悬于120微升含5毫摩尔EDTA的1xIB缓冲液中，并转移至新的1.5毫升离心管中。

在4°C条件下，以3,200 ×g在微量离心机中再次离心5分钟后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于适量体积的含10毫摩尔/升EDTA的Laemmli样品缓冲液中。将样品置于沸水浴中10分钟。随后通过SDS-PAGE对样品进行分析。

iOE17蛋白通过cpTat途径转运后，其引入的底物与成熟加工形式之间出现了两到三千道尔顿的大小迁移。这是由于N端信号肽被切除，表明cpTat转运成功。经嗜热菌蛋白酶处理后，仅保留成功转运因而具有蛋白酶抗性的成熟条带。

OE33前体通过CPSec1途径转运后，成熟底物出现分子量偏移，并对蛋白酶具有保护作用。LHCP前体通过cpSRP途径插入类囊体膜，经嗜热菌蛋白酶消化分析，其分子量减少了1.5至2千道尔顿，表明成功实现了膜插入，因为膜结构保护了未切割的成熟LHCP降解产物免遭完全蛋白水解。

观看本视频后，您应能充分理解如何分离类囊体，并检测物质通过依赖能量的cpTat、cpSec1和cpSRP途径的转运能力。若操作熟练，该技术在正确执行时可在三到四小时内完成。尽管本视频未作展示，但我们在实验室中分离和处理具有光合作用活性的叶绿体及类囊体时，通常会关闭实验室的顶灯。

进行此操作时，务必将分离的叶绿体和类囊体保持在4摄氏度。开始时请轻柔地重悬叶绿体。第一次离心后，避免扰动Procoll梯度。

此外，可同时制备输入样品的百分比样品，并与转运反应一同上样至同一凝胶，以估算底物的转运情况。请注意，操作放射性底物时必须谨慎处理，并穿戴适当的个人防护装备。该技术建立后，为蛋白质靶向领域的研究人员探索蛋白质跨类囊体膜转运的能量学、动力学及独特机制开辟了道路。