通过蓝色天然凝胶电泳分析类囊体膜蛋白复合物

该方法有助于解答有关植物类囊体膜中光合作用蛋白复合物组成及其动态组织方式的关键问题。该技术的主要优势在于，能够分析天然蛋白复合物之间的功能相互作用，并揭示在不同环境条件下蛋白复合物组织的可塑性。根据制造商的说明，使用0.75毫米间隔片安装凝胶铸模器，配置8厘米×10厘米的玻璃板。

将梯度混合器置于搅拌台上，并用管路将其与蠕动泵连接。将注射器针头连接到管路的另一端，并将针头放置在玻璃板与铝板之间。将磁力搅拌子放入较重的腔室中。

按照文本方案中的说明，在15毫升锥形离心管中配制3.5%和12.5%的丙烯酰胺溶液，用于制备分离胶梯度。为防止过早聚合，在配制溶液期间应将离心管置于冰上。在将溶液转移至梯度混合器之前，立即加入5%过硫酸铵（APS）和TEMED。

用移液器将12.5%的溶液转移至重液室。打开连接轻液室与重液室的阀门，使溶液流入轻液室，从而排出连接通道中的气泡。关闭阀门，并将残留的溶液重新移回重液室。

最后，用移液器将3.5%的溶液加入光反应室中。打开磁力搅拌器。打开阀门，并启动蠕动泵。

让凝胶溶液在玻璃板和铝板之间以大约每分钟0.5毫升的流速流动。针头必须始终位于液面之上。当重链室和轻链室排空后，用超纯水将其重新充满。

让水缓慢地覆盖在凝胶表面。凝胶聚合在室温下需要约一到两小时。在室温下配制用于浓缩胶的3%丙烯酰胺溶液。

用移液器将浓缩胶加在已聚合的分离胶上方，并在玻璃板和铝板之间插入样品胶梳，注意避免产生气泡。室温下静置聚合30至60分钟后，在超纯水中轻轻取出胶梳。此时，凝胶可在湿润条件下于4°C保存数天。

用预冷的25BTH20G缓冲液将分离的类囊体稀释至叶绿素终浓度为1毫克/毫升。每种类囊体样品准备两管，分别用于β-DM和皂苷溶剂化处理。然后加入等体积的去垢剂缓冲液。

用移液器轻轻混合去污剂和类囊体样品，避免产生气泡。对于β-DM溶解，将类囊体在冰上溶解两分钟；对于皂苷溶解，则在室温下持续轻柔地在摇床或振荡器上混合10分钟。

孵育结束后，在4°C条件下以18,000 g离心20分钟，去除不溶性物质。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并向样品中加入十分之一体积的考马斯亮蓝缓冲液。在垂直电泳系统中安装凝胶。

向阳极缓冲液室中加入蓝色阴极缓冲液，并将阳极缓冲液倒入下层缓冲液室。将类囊体样品加入上样孔中。启动电泳，并按照文本方案中列出的条件逐步增加电压。

在4°C条件下运行凝胶电泳，可通过冷室或使用冷却系统调节凝胶温度来实现。当样品前沿迁移至凝胶约三分之一处时，将蓝色阴极缓冲液更换为无色阴极缓冲液。电泳结束后，使用图像扫描仪对凝胶进行扫描以存档图像。

进行2-SDS PAGE时，使用一毫米垫片组装垂直电泳系统。按照文本方案中的描述，制备含有2-D梳子的标准SDS凝胶。切下BN凝胶中的泳道，并将其放入5毫升离心管中。

然后加入 2 毫升 Laemmli 缓冲液，将条带在室温下轻轻振荡孵育 45 分钟。借助间隔器将条带放置在凝胶上方，避免产生气泡。取 5 微升分子量标记物滴加到一小条窄滤纸上，并将滤纸放入标准加样孔中。

为了密封BN胶条和标记纸，将0.5%琼脂糖运行缓冲液倒在胶条上方，使其凝固。按照标准方案进行电泳。电泳结束后，使用SUPRO Ruby染色或银染法对蛋白质进行显色观察。

此处展示了使用β-DM和皂苷溶解释放的类囊体蛋白复合物模式的代表性结果。在电泳过程中，较小的复合物迁移较快，因此位于凝胶的下部，而较大的复合物则位于凝胶的上部。

Digitonin 通常能够保持蛋白质复合物在较大组装结构中的完整性，而 beta DM 则会干扰复合物之间不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。本文展示了经 beta-DM 和 digitonin 溶解的类囊体中蛋白质复合物的亚基组成。每个复合物的亚基可通过其下方对应的垂直线确定。

理论上，二维凝胶中的每个点代表一种单独的蛋白质。但实际上，一个点中可能含有多种分子质量相同的蛋白质。这些点的鉴定依赖于质谱分析。

应用此方法后，可进一步采用其他技术，如电子显微镜及对从蓝色天然凝胶中洗脱的蛋白质复合物进行单颗粒分析，以获得蛋白质复合物的结构信息。为了鉴定未知的蛋白质亚基，可对二维SDS-PAGE中的各个蛋白质斑点进行质谱分析。请注意，丙烯酰胺和皂苷（digitonin）具有极强的危害性，在操作本实验流程时，务必采取防护措施，例如佩戴防护手套。