基于¹⁵N代谢标记与定量质谱法的多蛋白复合物比较分析新方法

本实验的总体目标是在不同条件下，对脊髓膜中MultiPro复合物的组成进行比较分析。首先，从处于厌氧条件下的拉莫纳细胞中分离脊髓膜；随后，将脊髓膜溶解并利用蔗糖密度梯度进行分级分离。

然后将目标组分等体积混合，并通过SDS-PAGE进行分离。最后，将考马斯亮蓝染色的条带用胰蛋白酶消化。最终，通过定量质谱分析样品，以观察不同研究组分间蛋白质丰度的变化。

与现有的定量蛋白质组学方法（如通过比较特定蛋白量）相比，本技术的主要优势在于：在我们的方法中，将等体积的分馏样品混合并进行分析。这使得能够研究蛋白质在梯度中的迁移行为，并进一步分析第三组膜中不同非蛋白质复合物的组成。关于所用菌株，在按照文本方案培养莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）菌株后，使用以下储备溶液：2 M 蔗糖、10% beta-DM 水溶液以及 0.5 M Tris（pH 8.0）。

为制备用于蔗糖密度梯度的以下溶液，并使用14 × 89毫米离心管建立梯度，首先缓慢加入1毫升1.3摩尔溶液，随后加入1毫升1.0摩尔溶液。然后依次加入0.85、0.7、0.65和0.4摩尔溶液各2毫升。将梯度溶液在冷室中保存过夜，以诱导厌氧条件。

在衣藻培养物中，将玻璃移液管插入培养瓶，通入氩气，持续搅拌并光照四小时，以分离类囊体膜。孵育结束后，在4°C条件下以2,500 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于30毫升H1缓冲液中。

重复离心操作，再次重悬。将细胞重悬于H one缓冲液中以裂解细胞，随后在1,500帕斯卡的氮气压力下通过雾化器处理。确保陶瓷球与金属之间的距离足够小，以使细胞破裂。

然后在 2,500 × g、4 °C 条件下离心 7 分钟，使细胞沉淀。上清液应呈浅绿色。若细胞破碎成功，则将细胞重悬于 50 mL H₂O 缓冲液中，并在 32,800 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟以收集沉淀。

然后，将细胞重悬于10毫升H3缓冲液中，使用玻璃匀浆器匀浆重悬的细胞。接下来，制备蔗糖密度梯度。起始时使用12毫升H3缓冲液中的细胞。

然后缓慢加入一层12毫升的H四缓冲液，最后加入12毫升的H五缓冲液。使用H五缓冲液平衡转子，并在70,700 × g条件下离心梯度液1小时。从梯度液中收集TH条带，并用适量的H六缓冲液进行稀释。

在4°C条件下，以37,900 × g离心20分钟使细胞沉淀。如果沉淀不紧密，可在离心步骤中加入更多H6缓冲液。然后重悬。

将类囊体膜悬浮于少量 H six 缓冲液中，以加载光系统蔗糖密度梯度。首先，计算每个梯度所需的类囊体膜、β-DM 和 H six 缓冲液的用量。根据这些指导原则，每个梯度应含有 0.8 毫克/毫升叶绿素，溶于 0.9% β-DM 中，H six 缓冲液将最终体积调至 700 微升。

为了溶解类囊体，为每个梯度分别配制含有类囊体β-DM和H6缓冲液的Eloqua溶液。将样品在冰上孵育20分钟，每隔几分钟颠倒混匀一次。在4℃条件下，以14,000 × g离心10分钟。

沉淀应呈细小白色，上清液呈深绿色。将上清液加载至已用 H six 缓冲液平衡的梯度中，于 134,470 ×g、4 °C 条件下超速离心 14 小时。离心结束后，先拍摄梯度图像，然后进行组分分离。

使用针头在管底穿孔，并将组分收集到500微升的管中。或者采用96孔板进行处理。根据此处所示的文本方案，对凝胶消化和质谱分析中的SDS-PAGE样品进行处理，使用野生型的免疫印迹分析组分六和ΔPS1的组分13的结果。

本图中选择了A峰和R1峰的组分，用于分析环式电子传递超复合体的组分。图中显示了野生型与ΔPS1突变体在14N/15N标记下，PS1核心蛋白及PS1捕光蛋白，以及被指认为环式电子传递超复合体组分的多个蛋白的相对蛋白丰度比值（野生型/ΔPS1）。NR1和CAS在野生型与ΔPS1的第6和第13组分中丰度差异表明，它们可能是该复合体的新组分。此处展示了野生型与PG L1基因敲除株之间环式电子传递超复合体的定量比较结果。有趣的是，HCF136、细胞色素b6、细胞色素b6f亚基4和PETC在野生型中富集，而FTSH2、细胞色素f和PETO在PG L1突变体中富集。

观看本视频后，您将能够充分理解如何在不同条件下比较双液相膜中MultiPro复合物的组成。需要注意的是，液相膜的成功制备以及环式电子传递链的分离，关键步骤包括超级复合物细胞的破碎、细胞的匀浆以及液相膜的纯化。此外，蔗糖密度梯度离心至少需要12小时，才能实现光合作用复合物的完全分离。