小鼠前列腺叶的鉴定、组织学表征及用于体外三维球体培养模型的分离

该方法有助于启动前列腺癌的基因工程小鼠模型，并通过体内和体外分析研究前列腺癌的机制。该技术的主要优势在于，它能够对前列腺癌小鼠模型进行完整分析，涵盖从组织解剖到细胞分离与培养的全过程。暴露泌尿生殖系统（UGS）后，用中等钝头镊子牢固夹住膀胱，并将整个系统从小鼠腹腔中提起。

将一把剪刀插入膀胱和前列腺下方，一直深入至脊柱，切开脊髓，并剪断与腹腔相连的其余组织，以便完整取出整个尿生殖窦（UGS）。将尿生殖窦转移至一个六厘米的培养皿中，培养皿内含有 2 至 6 毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并在解剖显微镜下操作。使用一对精细镊子和显微解剖剪，小心清除组织系统背侧和腹侧的所有脂肪组织，注意不得剪切任何前列腺组织。

当所有脂肪组织完全去除后，用镊子夹住膀胱并从其基底部将其切除。将剩余组织腹侧朝上放置，用镊子夹住一侧导管末端，用剪刀沿血管向其基底部游离，并在基底部将其切断。以相同方式切除另一侧的血管，将镊子插入精囊与前列腺之间，必要时剪断相连的结缔组织。

然后沿精囊追踪至其在尿道的基部，并在不刺破的情况下将其血管去除。当两侧精囊均被移除后，将组织背侧朝上放置，使呈蝴蝶翅膀状的背侧叶清晰可见。用镊子夹住每个背侧叶，用剪刀在基部剪开组织以收集背侧叶，并将组织翻转至腹侧。

采集侧叶，侧叶体积较小，通常位于尿道侧面，以相同方式夹在前叶、腹叶和背叶之间。采集腹叶，腹叶较侧叶更大，位于尿道腹侧。随后剪切并弃去尿道，以收获前叶。

为了进行前列腺组织的三维培养，将组织叶转移到含有两到三毫升 DMEM 的 10 厘米培养皿中，使用手术刀尽可能细致且均匀地切碎前列腺导管。将组织碎片转移至无菌的组织培养操作台，并将组织悬液加入一个新的 15 毫升离心管中。用新鲜培养基将管内液体体积补至 9 毫升，然后向组织混合物中加入 1 毫升 TenX 胶原酶储备液。

涡旋后，将离心管在37摄氏度下振荡孵育两小时，以降解细胞外基质。孵育结束后，通过离心收集组织，并将沉淀重悬于2毫升温热的含0.5% EDTA的溶液中。在37摄氏度下继续孵育5分钟，以促进细胞间及细胞与基质间黏附的解离，随后使用带有宽口吸头的P1000移液器吹打组织8至10次，以分散任何团块。

使用P200枪头重复解离操作。然后加入三毫升完全培养基中和胰蛋白酶。将500单位的DNASE1混入组织悬液中，并将溶液通过装有18号针头的五毫升注射器反复吹打5至10次，再通过20号针头反复吹打5次。

当看不到较大的组织块时，将悬液通过40微米滤膜过滤至50毫升锥形管中，并通过离心收集细胞。进行细胞铺板和培养时，将细胞沉淀重悬于0.5毫升完全前列腺上皮细胞生长培养基中，并将细胞浓度调整为每毫升前列腺上皮细胞生长培养基含5 × 10⁵个细胞。按2:3的体积比将细胞与基底膜细胞外基质混合，然后将细胞悬液接种至适当的实验用细胞培养容器中。

然后将细胞放入细胞培养箱中孵育30分钟。当细胞外基质凝固后，用预热的完全前列腺上皮细胞生长培养基覆盖培养物，注意不要扰动基底膜细胞外基质凝胶。随后将细胞放回细胞培养箱中培养5至10天，每2至3天更换一半培养基。

收集球体时，小心吸出培养基，避免扰动基底膜细胞外基质凝胶塞，每100微升基底膜细胞外基质加入1毫升Disbase溶液。使用细胞刮棒沿培养板底部轻轻刮取，使基底膜细胞外基质凝胶从板底脱离并进入上清液中，然后用移液器将整个溶液吹打一次，使凝胶塞破碎成较小片段。将细胞外基质片段置于细胞培养孵箱中孵育1至2小时，直至基底膜细胞外基质完全溶解。

然后将细胞悬液转移至15毫升离心管中，并通过离心收集细胞，以进行后续的下游操作。小鼠前列腺由四对叶组成，位于精囊和尿道的背侧和腹侧。

前列腺叶由多个腺体轮廓组成，每个轮廓包含一个腔隙，周围环绕着分泌性上皮细胞。不同叶的形态、细胞排列方式以及分泌物性质各不相同。分离的前列腺细胞在基底膜细胞外基质培养后最早第4天即开始生长形成类器官。

在接下来的1至6天内，大多数细胞会生长成实心球体，其中部分球体表现出不完整或完整的管腔结构。这些球状体还在细胞间连接处显示出强烈的β-catenin染色，且与F-actin染色共定位。在进行该操作时，必须严格遵循显微解剖的各个步骤。

例如，在前列腺叶仍与尿道相连时分离它们，以便根据各叶相对于尿道的位置确定其具体归属。完成解剖步骤后，分离得到的前列腺叶可用于后续分析，如RMA测序、Western blot或免疫染色。主要的三维培养技术可帮助您进一步深入了解前列腺癌的发生机制，因为您能够通过球状体监测活细胞的形态与行为变化，并在其中识别任何肿瘤性改变。

总之，这种前列腺分离和培养方法可结合多种下游应用，利用基因工程小鼠模型为研究前列腺癌的机制提供有价值的信息。