利用类器官培养评估小鼠前列腺上皮细胞的分化能力

与二维检测相比，三维类器官系统被认为更接近生理状态，能够提供有关生物学特性的宝贵信息，而这些信息通常难以获得。该系统具有良好的适应性，相较于体内方法，可更快速且以显著更低的成本进行药理学和遗传学操作测试。基质胶在室温下会凝固，因此操作起来非常困难。

只有在呈液态时才能用移液器吸取，并且必须保持在冰上。保持环的完整性至关重要。如果结构被破坏，可能对类器官的生长产生负面影响，并且在更换培养基时容易损失材料。

按照文本方案所述，首先制备小鼠前列腺基底细胞和腔面细胞。用500微升小鼠类器官培养基洗涤细胞沉淀，然后将沉淀重悬，细胞密度为每微升1,000个细胞。配制主混合液时，将悬浮于小鼠类器官培养基中的上皮细胞与基质凝胶混合，制备终浓度为25%细胞悬液和75%基质凝胶的混合物。

根据下游应用的不同，基底细胞通常以每80微升100至2,000个细胞的浓度接种，而腔面细胞则以每80微升2,000至10,000个细胞的浓度接种。对于每种细胞混合物，向24孔板的每个孔中加入80微升基质凝胶。用移液器将一滴液体加至孔壁的下半部分，避免直接接触聚HEMA涂层。

加入基质胶后，轻轻摇晃培养板，使基质胶-细胞混合物在孔的边缘形成环状。将24孔板正置于37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育10分钟，使基质胶部分凝固。孵育10分钟后，将24孔板倒置，继续孵育50分钟，使基质胶完全凝固。

然后，将350 µL预热的小鼠类器官培养基逐滴加入每个孔的中央。添加培养基后，将24孔板放回培养箱。为补充小鼠类器官培养基，将24孔板倾斜至45度角，使用P1000移液器轻轻从每个孔的中央吸出原有培养基，注意避免触碰基质胶环。

加入 350 微升预热的小鼠类器官培养基，操作同前。建议对培养超过五天的类器官加入更大体积的培养基，以防止关键营养物质和生长因子迅速耗尽。按之前方法吸出每孔中的培养基。

收集类器官时，使用移液器将一毫升预热的含dispase培养基反复吹打基质胶，直接喷射至基质胶环上，直至整个胶环完全脱落。将脱落的基质胶与类器官混合物转移至1.5毫升微量离心管中。按照文本方案中所述完成彻底消化后，向类器官沉淀中加入磷酸盐缓冲液，并通过轻弹管壁重新悬浮。

将类器官在室温下以800 × g离心5分钟，沉淀类器官，并使用微量移液器移除上清液。根据每10 µL紧实细胞体积加入100 µL蛋白质裂解缓冲液重悬类器官沉淀。轻弹管壁以充分重悬。

现在，将装有类器官的离心管浸入湿冰中，将超声破碎仪的探头轻轻接触微型离心管外壁进行超声处理。在继续按照既定方案进行 Western 印迹分析之前，以 20 千赫兹超声处理 40 秒。收集 24 孔板中的前列腺类器官时，按前述方法吸去每孔中的培养基。

在37°C、5% CO2培养箱中，用含有500微升dispase的培养基孵育30分钟，以消化基质凝胶。将消化后的类器官悬液收集至微量离心管中。随后，在室温下以800 × g离心3分钟，使类器官沉淀，并弃去上清液。

为了对前列腺类器官进行整体免疫荧光染色，首先加入500微升含4%多聚甲醛的PBS溶液。在室温下轻轻振荡孵育类器官2小时。按照文本方案中所述清洗沉淀物后，将1微克/毫升的DAPI染料溶于封闭液中并加入，室温孵育2小时。

从这一步开始，在孵育过程中需避光保护样本。将类器官按前述方法离心后，加入含有初级抗体的封闭液，于4°C轻轻振荡孵育过夜。再次离心收集类器官沉淀，并用1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。

重复此洗涤步骤两次。然后在封闭液中加入二抗，于4°C轻轻振荡孵育过夜。孵育结束后，离心收集类器官，再对沉淀物额外洗涤两次。

向沉淀的类器官中加入1 mL含1% Triton X-100的PBS配制的30%蔗糖溶液，然后在室温下轻轻振荡孵育2小时。再次离心收集类器官后，加入1 mL含1% Triton X-100的PBS配制的45%蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡2小时。

然后重复上述操作，但加入1毫升含1%Triton X-100的60%蔗糖PBS溶液。在室温下以800 × g离心3分钟，使类器官形成沉淀，并移除95%的上清液。在紫外光下观察沉淀物，以确认其在去除上清液过程中未丢失。

随着蔗糖浓度的升高，沉淀物会变得更为松散。取10至20微升剩余的悬浮液转移至带腔盖玻片中，随后进行共聚焦显微镜观察。基底细胞和腔面细胞会形成具有不同形态的类器官。

尽管大多数基底细胞来源类器官在培养7天后大小相似，但腔面细胞来源类器官表现出显著的异质性。此外，大多数基底细胞来源类器官含有由多层上皮包围的管腔，而腔面细胞来源类器官在形态上则呈现多样性，从具有单层上皮的中空结构到由无法形成管腔的多层细胞索组成的实心结构均有存在。Western印迹分析显示，基底细胞和腔面细胞来源类器官均保留了与其对应的原代基底细胞和腔面细胞相关的特征。

基底来源类器官表达更高水平的基底标志物细胞角蛋白5，而管腔来源类器官则表达更高水平的管腔标志物细胞角蛋白8。在总体细胞群体中，基底和管腔来源的类器官均检测到基底和管腔标志物，可能提示存在分化现象。基底来源类器官包含多层上皮结构，外层表达高水平的基底标志物p63，内层则无法检测到该标志物的表达。

外层还表达中等水平的腔面标志物细胞角蛋白8，而内层则表达高水平。在单层腔面来源的类器官中，所有细胞均对细胞角蛋白8呈阳性染色，但仅有部分细胞含有核内p63。在处理基质胶时需格外小心，以确保在将细胞接种到类器官培养物之前，基质胶不会过早硬化。

用于显微镜检查的DAPI可能引起皮肤刺激。紫外线也可能有害。必须配备适当的个人防护装备。

我们可以从类器官中收集RNA，以进行RNA测序，从而了解基因表达谱在类器官形成过程中或对干预处理的响应中如何变化。该模型使前列腺研究领域获得了一种可重复的体外实验体系，可用于研究上皮生物学的基本特征，并鉴定发育和分化过程中的调控因子。