使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养

用于分离神经元的微流控装置已成为神经科学领域的标准工具，使研究人员能够对神经元的亚细胞区域（包括胞体、轴突、树突和突触）进行物理和化学操控。这些分区培养装置有助于回答神经科学领域的诸多问题，例如：在发育过程中轴突如何延伸以形成突触，轴突损伤后突触如何重塑和重建，以及在阿尔茨海默病等疾病中病理状态如何通过突触跨突触传播。本方案描述了使用预组装的塑料多腔芯片对原代大鼠神经元进行分区培养的方法。

使用这些芯片的主要优势在于，它们提供了一种易于使用且高度可重复的神经元分区方法。另一优势是，与以往基于硅的分区装置相比，这些芯片能够实现更健康、更长期的神经元及分离轴突的生长，同时同样适用于高分辨率显微镜观察。其他模型系统，包括人源干细胞，也可在预组装的分区芯片中进行培养。

首先，将一个无菌的多室芯片放入培养皿中。向芯片的左上孔加入100微升预编码溶液，并使其流经主通道进入相邻的孔。接着，向芯片的左下孔加入100微升预编码溶液。

这一次，等待五分钟，使溶液流经微通道。现在，向右上方的孔中加入 100 微升预编码溶液，并使其流经主通道进入相邻的孔。90 秒后，用 100 微升预编码溶液填充右下方的孔，并将芯片孵育 10 分钟。

将移液器吸头小心地倾斜，远离主通道，从每个孔中吸取溶液。然后，立即向左上方的孔中加入 150 µL PBS，并等待 1.5 分钟。接着，向左下方的孔中加入 150 µL PBS，并等待 5 分钟，使液体流经微沟槽。

然后，按顺序向右上和右下孔中各加入 150 微升 PBS。10 分钟后，再次吸除 PBS，并重复洗涤步骤第二次。第二次洗涤后，如前所述，将移液枪头倾斜，避开通道开口，从孔中吸除 PBS。

然后，向芯片的左上孔中加入 100 µL 的 0.5 混合每千分之一聚-D-赖氨酸溶液。等待一分半钟后，用 100 µL 聚-D-赖氨酸溶液填充左下孔。在芯片的右侧部分重复此操作。

关闭培养皿，然后将芯片置于37摄氏度的培养箱中孵育1小时。孵育结束后，用PBS缓冲液冲洗芯片两次，方法同前。

接下来，从装置中吸除 PBS。立即向芯片的左上孔加入 100 微升细胞培养基。1.5 分钟后，向左下孔加入培养基。

等待五分钟，使培养基流经微沟槽，然后在芯片右侧重复加样过程。根据既定方案制备解离的大鼠海马神经元细胞悬液。吸除芯片各孔中的大部分培养基，但保留通道内的液体。

接下来，立即将5 µL细胞悬液加入右上孔，另取5 µL细胞悬液加入右下孔。加样时，将移液器枪头对准主通道。加样完成后，将芯片转移至显微镜载物台上，确认神经元位于主通道内。

等待细胞贴壁五分钟后，向每个右上和右下孔中各加入约 150 微升神经元培养基。然后，向每个左上和左下孔中各加入 150 微升培养基。盖上培养皿，将芯片置于加湿托盘中，放入含 5% 二氧化碳、37°C 的培养箱内。

首先，从轴突区室的左下孔中移除 20 微升液体，并将其加入胞体区室的右上孔中。等待两分钟，使每个通道内的液体流动达到平衡。接着，从轴突区室中取出 50 微升培养基，并向其中加入 0.3 微升浓度为 1 毫摩尔的 Alexa Fluor 488 肼。

用移液器反复吹打以混匀溶液，然后将含有荧光染料的培养基重新移回轴突室。此时，将芯片置于显微镜下，按需进行成像。若需在芯片内进行轴突切断（axotomy），首先从轴突室中移除培养基，移液时需使移液器尖端远离主通道的入口。

暂时将移除的培养基存放在离心管中。接下来，将吸液毛细管靠近轴突室主通道的任一入口，彻底吸除轴突室中的液体。继续对该区域进行抽吸 1 至 2 分钟。

更换轴突室中的储存培养基。在显微镜下观察样本，确保 compartment 中的溶液已完全移除且轴突已被切断。然后盖上芯片并放回培养箱中。

开始荧光免疫染色时，移除芯片中的大部分培养基，同时保持内部腔室湿润。立即向轴突和胞体腔室的上部孔中加入 100 µL 固定液。一分钟后，向底部孔中加入 100 µL 固定液，并在室温下固定细胞 30 分钟。

吸除小室中大部分溶液，立即向轴突和胞体区室的上部小室中各加入150 µL PBS。等待2分钟，使PBS流入下部小室，然后吸除PBS，并重复此步骤再冲洗两次。最后一次冲洗后，吸除芯片小室中大部分PBS，立即向轴突和胞体区室的上部小室中各加入含0.25% Triton X-100的150 µL PBS。

等待15分钟，然后吸出孔中大部分液体。立即向轴突和胞体区室的每个上孔中加入150微升封闭液。15分钟后，吸出孔中大部分液体，并立即向轴突和胞体区室的每个上孔中加入100微升一抗溶液。

覆盖芯片以尽量减少蒸发，并在室温下用一抗孵育细胞1小时。随后，通过吸除大部分溶液，并立即向轴突室和胞体室的每个上层小孔中加入150 µL PBS，清洗芯片。5分钟后，吸去两个小孔中的PBS，并重复该清洗步骤两次。

现在，吸出各孔中的大部分液体，并立即向轴突和胞体区室的上层孔中分别加入 100 µL 用 PBS 配制的二抗。盖上芯片以减少蒸发，并在室温下孵育 1 小时。如前所述，用 PBS 洗涤芯片三次，然后按照随附的文字版实验方案所述进行封片和成像。

此处展示的是在塑料芯片和PDMS装置上培养的神经元的并列比较。在培养的前15天内，两种平台上的神经元生长情况相当；但在更长时间的培养后，塑料芯片中的孤立轴突表现出更少的搏动，形态更健康。为了进一步可视化轴突区室内的轴突，这些样品还进行了β-tubulin III免疫染色，结果显示在培养22天时，塑料芯片内存在健康的轴突生长。

对培养24天的样品进行进一步染色显示，在塑料芯片中生长的神经元表达兴奋性和抑制性突触标志物vGlut1和vGat。图中为两种突触标志物与逆行标记的mCherry神经元的共定位结果。为验证该芯片适用于轴突损伤与再生研究，我们在轴突切断前及切断后24小时对逆行标记的神经元进行了成像观察。

轴突切断后，回缩球和再生轴突均清晰可见。这些结果与使用基于PDMS的装置发表的数据相当。经典的多室芯片为神经元的区室化提供了一种易于使用的方案，可建立长期神经元培养，细胞活力可持续超过三周。

进行该操作时，重要的是要记住接种适当数量的神经元，并确保培养过程中培养箱具有良好的湿度。