用于神经元胞体与轴突区室化培养的微流控装置的制备

欢迎来到Newly John博士的实验室。John实验室专注于为生物应用开发微流控平台。在本视频中，我们将演示一种用于初级神经元分隔与培养的微流控装置的制备与使用方法。

神经元装置最初于2005年8月发表在《自然·方法》上。自推出以来，全球各地的合作者已广泛使用该神经元装置。该装置由一块聚二甲基硅氧烷（PDMS）构成，该材料浇铸于含有所需装置SUA图案的硅片上，而该图案此前通过光刻技术制备而成。

该装置具有三个主要特征：四个直径为8毫米的储液池，两条主通道（每条宽1.5毫米、长7毫米、高100微米），以及连接两条主通道的微沟槽（宽10微米、高3微米）。微沟槽的长度可在150微米至900微米之间变化，但通常选择的标准长度为450微米。当观察装置使主通道与微沟槽呈垂直方向时，可以看到沟槽左侧的储液池通过主通道相互连接，右侧的储液池 likewise 也是如此。

该功能允许液体流经主通道，这一重要特性使得细胞接种和培养基更换成为可能。与传统的组织培养平台相比，神经元装置具有三大优势。其一，它能够实现细胞体（胞体）与轴突的共区域化分隔。利用该神经元装置，可以获得高纯度的轴突组分。

微沟槽的尺寸和长度允许轴突穿过另一主通道，同时阻止胞体通过。第二，由于该装置的设计并利用静水压力，只需使装置一侧的储液池体积高于另一侧，即可独立地对细胞侧和/或轴突侧进行不同处理。第三，可通过真空抽吸切断装置中的纯轴突部分，使研究人员能够研究和观察轴突再生过程。

研究人员 Hina Lee 现在将演示微流控神经元装置的制备过程。使用经光刻法在三英寸硅片上制备出 SU-8 图案，以此浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控模具。我们将带有 SU-8 图案的硅片称为母模，或简称为“母模”（masters）。

PDMS 与固化剂按重量比10:1混合。例如，每15克PDMS加入1.5克固化剂。将PDMS充分混合后，倒入硅片上。

硅片置于一个10厘米的聚苯乙烯培养皿中。覆盖微结构阵列（MAs）所需的聚二甲基硅氧烷（PDMS）量约为12克至15克，厚度约为4毫米。将带有PDMS的模具放入真空干燥器中，培养皿盖子打开，然后施加真空。

这样做的目的是帮助去除在搅拌固化剂过程中引入PDMS中的气泡。去除气泡大约需要15分钟。将含有PDMS的模具在真空干燥器中放置15分钟后，从干燥器中取出。

PDMS母模上仍残留少量气泡。使用带有0.45微米滤膜的气枪去除残留气泡。随后将母模置于80摄氏度的加热板上固化一小时。

如果无法提供真空干燥器，可将模具在室温下静置数小时，气泡最终会自行消失。若无加热板，PDMS 在室温下放置 24 小时后也可固化。

在固化过程中，必须确保模具处于水平状态。PDMS在模具上固化后，将其转移至洁净罩中，并使用手术刀沿器件边缘进行环形切割。

在将刀片插入PDMS以接触硅片时，必须注意不要对硅片施加过大的压力，否则模具会在器件周围完全切割出一圈裂纹而破裂。每块三英寸的硅模具上含有四个器件。随后小心地将PDMS从模具上剥离下来。

插入手术刀片时可轻轻旋转，以开始操作。由于PDMS器件在模具上非常薄，因此需格外小心。使用8毫米组织活检打孔器，在器件上打孔形成向上开口的储液池。

用一根棒将打孔器中残留的碎屑推出。然后将装置切成四等份，并修剪掉多余的PDMS，以便装置能够整齐地贴合在康宁盖玻片上。使用24毫米×40毫米的1号玻璃片，并用氮气吹走任何多余的碎屑。

顽固的残留物也可使用 3M Scotch Brand 4 7 1 乙烯基胶带去除。清洁后的器件现已准备好进行等离子体键合。使用Herrick等离子清洗机将神经元器件短暂地键合到盖玻片上。

将装置和盖玻片放置于托盘上，然后将托盘放入等离子清洗仪中，并使用真空泵抽去腔室内的空气。需要注意的是，PDMS装置应正面朝上放置，即图案面朝上，以便暴露于等离子气体中。

当真空压力达到300毫托时，将电源接通至电热线圈并调至高功率。将门上的阀门稍微打开，使少量空气进入腔室，以助于产生等离子体。器件和盖玻片进行等离子体处理两分钟。

注意腔室中的紫色。这就是实际的等离子体。电磁线圈产生等离子体，等离子体是一种部分电离的气体，由电子、离子以及中性原子或分子组成。

等离子体会在玻璃和器件表面产生活性物质，当两者接触时会形成永久性结合。等离子体还使表面变为亲水性，有助于液体的添加。等离子清洗机还可对器件进行灭菌。

等离子体处理两分钟后，关闭真空电源并向腔室内通入空气。在洁净台中将经过等离子体处理的玻璃表面与微流控器件紧密接触并组装在一起。然后将器件置于无菌的60毫米培养皿中。

经过等离子体处理的玻璃表面与装置表面会形成紧密且不可逆的结合。在等离子体键合后的10分钟内，需将玻璃多醇赖氨酸加入装置中。10分钟后，装置的亲水性将下降。

这使得PLL难以进入装置。加入PLL后，必须检查装置内是否存在气泡。去除气泡的一个简便方法是使用P200移液器，吸取100微升液体进行操作。

在此情况下，使用PLL将枪头直接置于主通道的开口处，然后用力按压P200移液器。此步骤可能需要重复数次，但最终移液器产生的压力将驱除气泡。含有PLL的装置置于标准组织培养孵箱中，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。

与PLL孵育24小时后，用高压灭菌的去离子水快速冲洗装置两次。在此过程中，液体仅从储液池中完全移除，主通道中的液体则从不完全移除。若将主通道中的液体移除，会引入气泡。

经过两次快速冲洗后，再次用高压灭菌的去离子水充满装置，并放回培养箱中孵育至少三小时或过夜。第二天，在装置中用去离子水孵育过夜或至少三小时后，再次将其移入生物安全柜中，用去离子水冲洗两次。然后向装置中加入含有必要添加剂B-27和谷氨酸的神经基础培养基，用于原代大鼠神经元的培养。

随后将这些装置放回培养箱中以备后续使用。这些装置现已准备好用于接种神经元。在本视频中，我们展示了用于制造神经元装置的软光刻技术。

这些装置可用于培养神经元及其他感兴趣的细胞类型。这类装置的主要优势在于能够将神经元胞体的培养与轴突纯化部分分隔开来，分别位于装置的两侧。在接下来的视频中，我们将向您展示如何制备E18胎鼠大脑皮层神经元，以及如何将细胞接种到装置中。

以上就是约翰实验室的全部内容。感谢观看。