用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

本方案可制备安全高效的纳米脂质体，可用作治疗性信使RNA的转染载体。这些纳米脂质体可促进细胞对mRNA的摄取，从而在不影响细胞活力的情况下提高蛋白表达水平。该技术的主要优势在于能够快速、简便地生成具有明确尺寸和均一分布的稳定纳米脂质体。

此外，它们可保护包封的mRNA免于降解，从而实现更持久的翻译。本实验操作将由本实验室的博士生Antonia Link进行演示。开始此操作前，需制备脂质DC-胆固醇和DOPE的储备液：将每种脂质分别溶于氯仿中，配制成终浓度为25毫克/毫升的溶液。

在玻璃烧瓶中，将40微升溶解的DC-胆固醇与80微升溶解的DOPE混合。在氩气气流下蒸发氯仿15分钟。接着，用硅胶填充干燥器。

将敞口玻璃烧瓶放入其中，并抽真空过夜，以确保残留的氯仿完全蒸发。脂质薄膜将在玻璃烧瓶内形成。次日，加入 1 毫升无核酸酶水以重新水合脂质膜。

将悬浮液涡旋振荡15分钟。将悬浮液置于超声水浴中处理一小时。之后，按照制造商的说明组装微型挤出器。

用液体悬浮液填充注射器，并将其置于挤出器的一侧。在另一侧放置一个空注射器。将脂质悬浮液通过膜从一个注射器推入另一个注射器，重复约20-25次，以完成悬浮液的挤出。

然后，将纳米脂质体储存在玻璃烧瓶中，置于 4°C 下，直至使用前。首先，将合成的 mRNA 在冰上解冻。涡旋冷冻的 mRNA，然后在打开管子前短暂离心。

然后，将一微克合成mRNA与不同量的纳米脂质体悬浮液混合。短暂离心后，在室温下孵育20分钟以形成纳米脂质复合物。接着，向纳米脂质复合物中加入一毫升常规细胞培养基，并通过上下吹打混匀。

转染前一天准备细胞。因此，在转染前24小时，将150,000个A549细胞接种至12孔板的每个孔中。将细胞在37°C、5%二氧化碳及常规细胞培养基条件下孵育24小时。

第二天，用一毫升 PBS 将已准备好的细胞板各孔清洗一次。向含有 A549 细胞的某一孔中加入一毫升已配制好的纳米脂质复合物混合液。在常规条件下孵育 24 小时以分析转染效率，或孵育 24 至 72 小时以分析转染后的细胞活力。

吸去上清液，每孔加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以去除残留的纳米脂质体。为准备流式细胞术分析，首先每孔加入500微升含EDTA的胰蛋白酶溶液，在37摄氏度孵育3分钟以消化细胞。接着，每孔加入500微升含常规胎牛血清（FBS）的培养基以终止反应并灭活胰蛋白酶。

以400 × g离心细胞5分钟。小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。用1 mL PBS洗涤细胞。

然后将细胞重悬于 300 微升细胞固定液中，并转移至流式细胞术检测管。使用流式细胞仪在 488 纳米波长下分析细胞。为进行荧光显微镜观察，向每个孔中加入 1 毫升预冷的甲醇以固定细胞。

向每个孔中加入500 µL溶于PBS的300 nmol/L DAPI溶液。避光孵育5分钟。随后，移除DAPI溶液，并用先前在-20 °C保存的100%甲醇再次洗涤细胞。

使用荧光显微镜，根据此处所示的激发和发射波长分析细胞。在本研究中，纳米脂质体对合成修饰的mRNA具有高效的包封率。通过RNA定量试剂盒，可在包封一微克编码eGFP的mRNA后，通过分析未被包封的游离mRNA量，来检测纳米脂质体的包封效率。

将EGFP mRNA包裹于不同剂量的纳米脂质体后，所形成的纳米脂质复合物可在体外与细胞共孵育，并在转染后24小时通过流式细胞术分析表达eGFP的细胞百分比。如图所示，即使仅使用1 µL纳米脂质体溶液，也足以在体外实现高效的细胞转染。当使用携带Cy3标记的eGFP mRNA的纳米脂质体转染细胞时，可在细胞质中观察到eGFP mRNA的存在以及已产生的eGFP蛋白。

由于使用纳米脂质复合物转染细胞可能对细胞产生不良影响，因此在转染后24小时和72小时检测了细胞的存活率。当细胞接受2.5或5微升纳米脂质复合物处理时，未检测到对细胞活力产生影响。在进行该操作时，必须始终注意在无乙醇的环境中操作，因为乙醇可能破坏纳米脂质体的稳定性。

在配制和混合DC-胆固醇与DOPE时，应使用玻璃移液管，以避免溶解的脂质被塑料移液管头中的可溶性成分污染。按照本方案操作，所制备的纳米脂质体在制备过程中或制备后均易于操作。例如，加入PEG分子或特异性抗体可提高其稳定性，或启动主动靶向特定组织。

制备的纳米脂质体满足必要的安全性要求，并可促进mRNA向靶细胞的摄取。与特定治疗性nRNA复合的纳米脂质体，可在组织工程或替代疗法等领域，为新型mRNA药物的开发做出重要贡献。