中性电荷、pH响应性聚合物纳米颗粒的制备及其用于细胞质siRNA递送

本方案具有重要意义，因为它使研究人员能够制备负载siRNA的纳米颗粒，并对这些纳米颗粒进行充分表征，以确保其在后续研究前适合用于动物给药。该方法的优势在于能够制备提高siRNA生物利用度的纳米颗粒，并生成呈中性电荷的纳米颗粒，从而适用于全身性给药。该技术具有重要影响，因为siRNA纳米颗粒可应用于多种需要全身给药的疾病治疗，包括癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病等。

首先，将聚合物溶解于乙醇中，浓度为 33.3 毫克/毫升，并搅拌以确保完全溶解。然后用移液器将聚合物溶液转移至 10 毫摩尔/升的柠檬酸缓冲液中，使聚合物终浓度为 3.33 毫克/毫升。向含有小干扰 RNA 的离心管中加入去离子水，使其浓度达到 50 微摩尔/升。

将聚合物溶液与小干扰RNA溶液在离心管中充分混合，通过反复吹打使氮与磷酸基团的摩尔比达到10。室温下静置30分钟。然后向管中加入1毫升pH为8的10毫摩尔磷酸缓冲液，使终浓度为0.28毫克/毫升，轻轻吹打或颠倒混匀。

为确认最终 pH 值为中性（约 7.2 至 7.5），将 10 微升小干扰 RNA 纳米颗粒溶液滴加到 pH 试纸上。首先，通过 0.45 微米孔径的注射器滤器，将 1 毫升浓度为 0.28 毫克/毫升的小干扰 RNA 纳米颗粒过滤至方形石英或聚苯乙烯比色皿中，制备动态光散射样品。然后根据仪器制造商的说明，使用动态光散射仪记录粒径和表面电荷的测量结果。

为通过透射电子显微镜确认小干扰RNA纳米颗粒的大小和形态，首先将5微升浓度为0.28毫克/毫升的过滤后小干扰RNA纳米颗粒溶液加入每张透射电镜载网中。将载网在室温下放置60秒，然后用滤纸 blot 干燥3秒。

接下来，向每个载网上加入5 µL的3%醋酸铀溶液，孵育20秒，用滤纸吸干3秒。然后将载网置于干燥器中过夜干燥，随后在透射电子显微镜下进行成像观察。

进行琼脂糖凝胶阻滞实验时，首先将两克电泳级琼脂糖粉末加入含有100毫升pH为8的1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液的烧杯中，以制备2%琼脂糖凝胶。搅拌以悬浮琼脂糖。将烧杯敞口置于微波炉中加热1至3分钟，直至所有琼脂糖完全溶解。

冷却后，向烧杯中加入5 µL浓度为10 mg/mL的溴化乙锭，并充分混匀。然后将琼脂糖倒入凝胶托盘中，并插入梳子以形成加样孔。让凝胶静置干燥30分钟。

小心移除梳子，留下加样孔，并将 1× Tris-乙酸-EDTA 缓冲液倒入凝胶托盘中，至最高加液线。然后，在石蜡膜上为每种不同氮磷比的小干扰 RNA 纳米颗粒制剂分别取两微升不含 SDS 或还原剂的上样染料。用移液器在石蜡膜上将 10 微升小干扰 RNA 纳米颗粒溶液与上样染料混合均匀。

将混合物加入琼脂糖凝胶孔中。将电泳系统连接至电源，以100伏电压运行35分钟，或直至样品迁移至凝胶长度的80%。将凝胶从托盘转移至紫外透射仪，根据制造商的说明在紫外透射仪下观察小干扰RNA条带。

根据凝胶底部小干扰RNA条带的消失情况，确定最佳的氮与磷酸盐比例。为敲低模型基因荧光素酶，首先将表达荧光素酶的细胞以每孔2,000个细胞的密度接种于96孔黑色壁板中，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将培养板放入培养箱中过夜，使细胞贴壁。

第二天早晨，吸去培养基，每孔加入10 µL用含血清完全培养基稀释的小干扰RNA纳米颗粒，使小干扰RNA的终浓度为100 nmol/L。将培养板放回培养箱中孵育24小时，以用小干扰RNA纳米颗粒处理细胞。次日，更换为含有150 µg/mL D-荧光素酶底物（D-luciferin）的含血清完全培养基。

在使用酶标仪检测发光之前，将细胞在室温下孵育5分钟。随后用不含D-荧光素的新鲜完全培养基更换培养基两次，每次孵育24小时。最后将培养基更换为含有150毫克/毫升D-荧光素的完全培养基，并在室温下孵育5分钟。

在48小时时间点测定发光信号。对于长期研究，在生物安全柜外操作时，将盖子保留在孔板上方，以维持细胞的无菌状态，并在用含新鲜完全培养基替换含荧光素的培养基后继续培养。动态光散射测量结果显示，小干扰RNA纳米颗粒一的平均直径为35纳米。

单个峰且峰宽较窄表明呈单分散分布且多分散性较低。透射电子显微镜（TEM）测量结果证实了动态光散射所得的粒径数据，提示小干扰RNA纳米颗粒具有均一的种群，并揭示了小干扰RNA纳米颗粒的球形形貌。在制备过程中，若聚合物浓度过高，则导致小干扰RNA纳米颗粒二出现大于200纳米的不良直径、多峰及多分散种群，并在溶液中形成聚集体，无明确的颗粒形貌。

小干扰RNA纳米颗粒一和二均表现出中性表面电荷，表现为接近零的平均Zeta电位值。琼脂糖凝胶阻滞实验显示，小干扰RNA条带在凝胶底部消失，表明小干扰RNA已与聚合物形成复合物。聚合物复合的小干扰RNA无法在凝胶中迁移，因此在加样孔附近的凝胶顶部可见。

随着氮磷比的增加，小干扰RNA的复合程度也随之增加，这表现为凝胶底部小干扰RNA条带的强度降低。与乱序对照相比，具有生物活性的荧光素酶小干扰RNA纳米颗粒一显示出显著降低的荧光素酶活性。相反，荧光素酶小干扰RNA纳米颗粒二不具有生物活性。

为了制备具有理想理化特性的稳定siRNA纳米颗粒，应使用浓度适当的聚合物溶液，并在实验方案的每一步骤中验证缓冲液的pH值。在研究中应用这些方法后，我们已成功开发出针对以往难以成药的致癌基因的siRNA纳米颗粒疗法，并在乳腺癌的临床前模型中测试了这些疗法的有效性。