利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

本方案可用于快速、高重复性地制备包裹核酸的脂质纳米颗粒，并可使用较低体积的试剂。可根据临床应用需求调节制剂参数，以实现理想的生物分布。微流控芯片采用标准的鱼骨状设计，可在混合过程中实现快速、精确且可控的层流流动。

该方法易于放大生产，可生成均匀且包封率高的颗粒。鉴于目前大多数已获商业批准的基因治疗产品依赖病毒载体，本方法因其非病毒递送途径，可为基因传递研究提供参考，尤其适用于需要重复给药的应用场景。首先，将适量的每种液体储备溶液依次加入玻璃小瓶中，间歇性涡旋混匀。

如表格所示，随后加入200 proof乙醇，使终体积达到533微升。然后加入适量的mRNA储备液，并用柠檬酸盐缓冲液稀释，以获得终体积为1.5毫升、浓度符合要求的溶液。为启动微流控通道，首先按照表格中所述，将启动参数输入仪器软件中。

接下来，打开仪器盖子，将微流控芯片放入旋转模块中。用1毫升注射器吸取至少500微升乙醇，注意注射器尖端不得有气泡或空气间隙，然后将注射器插入芯片的右侧入口。另取一支5毫升注射器，吸取1.5毫升柠檬酸盐缓冲液，确保其中无气泡或空气间隙，随后将注射器插入芯片的左侧入口。

将两个15毫升的锥形管放入夹持器中，作为废液容器，并点击“Go”以混合溶液。当仪器底部的蓝灯关闭，表明引液过程结束时，打开舱门，妥善处理锥形管和注射器。进行脂质纳米颗粒制备时，根据表格中所示设置相应的配方参数，并用预先配制好的脂质混合物装填一支1毫升注射器。

排除注射器尖端的任何气隙或气泡，并将注射器插入卡盒右侧。将先前制备的核酸溶液装入一个3毫升注射器中，注意确保注射器尖端无气泡或气隙，然后将注射器插入卡盒左侧入口。将标有样品名称的15毫升无RNA酶锥形管放入左侧管夹中，将15毫升废液锥形管放入右侧管夹中。

关闭仪器盖，然后点击“Go”。脂质和mRNA溶液将流经微流控芯片，脂质纳米颗粒溶液将被收集到锥形管中。在配方过程结束时保留最后一根锥形管，然后在生物安全柜中用5毫升PBS稀释脂质纳米颗粒。为进行缓冲液置换，首先用2毫升PBS预清洗孔径为100千道尔顿的超滤离心过滤器，离心后，将底部腔室中的PBS弃去。

将稀释后的脂质纳米颗粒加入预先洗涤过的超速离心滤器的上层室中，进行三次离心洗涤，每次离心后弃去滤过液，并在前两次洗涤后向超速离心滤器中加入 5 毫升 PBS。最后一次洗涤后，用移液器将脂质纳米颗粒溶液沿超速离心滤器管壁反复吹打数次，以尽量减少纳米颗粒的损失，然后将纳米颗粒溶液转移至无核酸酶的离心管中。随后根据需要加入 PBS，将纳米颗粒悬液调整至适当的实验浓度和体积。

为了评估脂质纳米颗粒的包封效率，首先在 PBS 中配制工作浓度的核酸溶液，从 500 纳克/毫升开始进行两倍系列稀释，至少配制五个稀释梯度，以生成标准曲线。接下来，在 PBS 中配制纳米颗粒样品的稀释液，使其理论浓度处于标准曲线中点附近。然后配制 RiboGreen RNA 检测试剂，通过混合适量的 RNA 检测试剂、Triton X-100 和 PBS，以检测脂质纳米颗粒内外的 RNA 存在情况。

然后，为了检测液态纳米颗粒外部是否存在RNA，仅将适量的RNA试剂与PBS混合。将核酸标准品和脂质纳米颗粒溶液的重复样本加入黑色荧光检测用96孔板中，随后向标准品和样本重复孔中分别加入等体积的RNA定量试剂，一组加入Triton X100，另一组不加。将酶标板置于酶标仪中，在室温避光条件下振荡5分钟，以充分混匀样品，然后在微孔板读数仪上以480纳米激发波长和520纳米发射波长测定荧光信号。

为了测定脂质纳米颗粒的流体动力学尺寸和多分散性，首先将纳米颗粒溶液在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释40倍，并将稀释后的溶液加入半微量比色皿中。将比色皿装入Zetasizer仪器，选择标准操作程序，根据纳米颗粒的材料、分散剂、温度和比色皿类型设置仪器参数。然后点击“开始”，以测量脂质纳米颗粒的流体动力学尺寸和多分散性。

为了测定脂质纳米颗粒的Zeta电位，需将纳米颗粒溶液在无核酸酶水中稀释40倍，并将稀释后的溶液加入比色皿至填充线处。将比色皿放入Zeta电位分析仪中，确保电极与仪器接触良好，并根据脂质纳米颗粒的具体组成设置仪器以测定Zeta电位。然后点击“开始”以测量脂质纳米颗粒的Zeta电位。

在本项分析中，不同日期制备了多批具有相同脂质配方和胺基与磷酸基比例的脂质纳米颗粒，以验证该技术的可重复性。如图所示，第一批次与第二批次的粒径分布重叠，多分散性相似，且各批次间的粒径和包封效率均未观察到显著差异。通常情况下，配方参数的改变会引发一些虽小但具有统计学意义的差异。

例如，降低胺基与磷酸基的比例会导致包封效率下降 4%，同时纳米颗粒的流体动力学直径相应增加。使用不同可电离脂质但具有相同胺基与磷酸基比例配制的脂质纳米颗粒，其包封效率表现出显著变化，粒子直径也存在轻微差异。与包封 mRNA 的脂质纳米颗粒相比，包封质粒 DNA 的颗粒尺寸更大，尽管这两类纳米颗粒均表现出相似的包封效率。

然而，流速这一工艺参数的变化不会影响脂质纳米颗粒的制备。脂质纳米颗粒具有广泛的应用前景，近期获批的新冠疫苗便是最佳例证。该技术提供了一套高效的工具，通过实现更少剂量的配方筛选，为未来的应用开辟了道路。