由微生物和化学刺激物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的形态学与成分分析

本方案展示了在体外可比条件下，健康个体中性粒细胞所释放的中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）在组成、结构和形态上的异质性，这种异质性取决于不同的诱导刺激。实验可获得高纯度和高活性的中性粒细胞，从而能够比较中性粒细胞胞外诱捕网所释放的DNA、LL-37以及髓过氧化物酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的酶活性浓度。

本方案可用于分析可溶性因子、细胞接触、潜在疗法或闭合机制对自身免疫性疾病中 NETs 生成的影响。这些方法有助于自身免疫性疾病的机制研究。由于 NETs 的细胞增殖失控及其组分的持续存在，这些组分被视为该疾病的生物标志物。

荧光显微镜可用于捕获中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的图像，显示DNA与蛋白质（如LL37）共同分布的情况，并与微生物共定位，有助于理解其形成过程。首先，进行静脉穿刺，使用含二钾乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的试管采集10毫升外周血。随后进行常规血液学分析和C反应蛋白检测，以排除感染或炎症，确保样本质量。

离心外周血样本以去除富血小板血浆，随后进行第二次离心并弃去剩余血浆。将所得的红细胞和白细胞沉淀物用1:1体积比的1×DPBS稀释。然后，在无菌的10毫升玻璃试管中，先加入1毫升密度为1.08克/毫升的溶液，再加入1毫升密度为1.079克/毫升的溶液。

然后，将稀释后的红细胞和白细胞混合液4毫升沿管壁缓缓加入。离心时不要设置升速和降速，以避免破坏密度梯度。吸取对应于粒细胞的层面，并转移至另一支无菌的10毫升玻璃试管中。

在4°C条件下，以300 G离心10分钟，用4毫升1×DPBS洗涤，并弃去上清液。为去除残留的红细胞，加入4毫升0.2%盐溶液进行低渗休克处理。在4°C条件下孵育2分钟，然后离心。

弃去上清液，加入4毫升0.65%生理盐水溶液。在4°C孵育5分钟以恢复膜完整性，然后重复离心。移除上清液，并将细胞重悬于4毫升1×DPBS中，以去除细胞碎片。

再次离心，并将细胞沉淀重悬于 2 毫升冷的 HBSS 缓冲液中。为进行台盼蓝排斥试验，取 5 微升细胞悬液与 20 微升 0.4% 台盼蓝溶液混合稀释。在新的血细胞计数板中计数细胞，并通过排斥试验确定细胞活力。

然后，取5 µL细胞悬液滴加到载玻片上，用瑞氏染色液染色15秒。立即固定样本，用蒸馏水冲洗，并在光学显微镜下观察细胞形态。接着，将1 × 10⁵个细胞加入流式管中，加入1 µL 7AAD染料溶于100 µL FACS缓冲液中，于4°C避光孵育15分钟。

以300 ×g离心10分钟，用500 µL FACS缓冲液洗涤。加入500 µL 2%多聚甲醛固定细胞，并于4°C保存直至进行流式细胞术分析。对于死细胞对照，用200 µL 4%多聚甲醛在4°C固定30分钟，然后以300 ×g离心10分钟，用500 µL 1×PBS洗涤。

弃去上清液，加入 200 微升 0.1% Triton X-100。在 4 摄氏度下孵育一小时。用 500 微升 1× PBS 洗涤，并用 7AAD 染色。

在流式细胞仪软件中分析捕获的数据。加载文件后，双击未染色的中性粒细胞文件。在X轴选择前向散射（FSC），在Y轴选择侧向散射（SSC），以显示对应于中性粒细胞的细胞群体。

然后在X轴上选择B3-A:PerCP vio 700-A通道以界定细胞的自发荧光，并在Y轴上选择直方图。接着，打开已染色的中性粒细胞文件，在X轴上选择FSC，在Y轴上选择SSC，以显示对应于中性粒细胞的细胞群。

再次选择通道 B3-A:PerCP vio 700-A，以界定对染料 7AAD 呈阳性的中性粒细胞群体。通过右键单击窗口并选择“复制到布局编辑器”生成最终直方图。在 1.5 毫升离心管中加入细菌或真菌假菌丝。

加入200微升含5微摩尔CFSC的1×PBS溶液。混匀后于37摄氏度避光孵育10分钟。加入500微升灭活血浆终止反应，并进行离心。

弃去上清液，用一毫升1×PBS重悬沉淀，离心洗涤。然后将微生物重悬于250微升1×PBS中。取50微升分装至1.5毫升微量离心管中，每管含两乘以十的七次方个细菌或两乘以十的五次方个假菌丝，用于NET诱导。

将10 mm × 10 mm的无菌玻璃盖玻片放入24孔板中。每孔加入10 µL 0.001%多聚-L-赖氨酸，在室温下孵育1小时，然后用100 µL 1× PBS洗涤两次。室温晾干后，用紫外光照射15分钟。

接下来，将先前制备的中性粒细胞悬液中的 HBSS 溶液替换为添加了 10% 经加热灭活的自体血浆的 RPMI 1640 培养基。取 350 微升该细胞悬液加入 24 孔板中，使每孔中性粒细胞终浓度为 2 × 10⁵ 个。将培养板置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 20 分钟，以使细胞贴附于孔底。

为诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，加入细菌刺激物（MOI 100）和假菌丝（MOI 1），同时加入生化刺激物。通过加入50微升HBSS制备无刺激物的对照组。每孔终体积为400微升，在平板摇床中以140 RPM振荡混匀30秒。

然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。净诱导后，小心用移液器吸去孔中的上清液，并加入300微升4%多聚甲醛固定细胞30分钟。用200微升1×PBS洗涤细胞，无需离心，再加入200微升封闭缓冲液，孵育30分钟。

进行LL37染色时，用200微升含0.2% Triton X-100的1×PBS溶液对细胞透化处理10分钟，随后用1×PBS洗涤两次。将盖玻片固定于载玻片上，用2微升DAPI对细胞进行DNA染色，染色后于-20°C保存，直至通过共聚焦荧光显微镜分析。

经双密度梯度纯化后，观察到细胞的动态变化阶段。通过瑞氏染色确认了典型的中性粒细胞形态。台盼蓝排斥法显示细胞活力良好，且细胞膜未见破损。

通过流式细胞术对SSC与FSC的分析证实，存在一群对应于PMN的细胞，且细胞纯度较高。未染色细胞与7AAD染色细胞的PMN散点图及其相应的直方图显示，与通透化对照细胞相比，新分离的中性粒细胞具有较高的细胞活力。在用化学和微生物刺激物刺激中性粒细胞后，通过荧光显微镜使用DNA染料DPI和抗LL37抗体对NETs进行可视化观察。

微生物预先用CFSE进行染色。PMA诱导的自杀性中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成表现为与LL37共定位。而由HOCI形成的NETs在细胞外空间显示出轻微的DNA弥散，对应于活性NET的形成。

由真菌假菌丝诱导产生的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）表现出较低浓度的DNA释放到细胞外空间，并具有典型活性NET形成的丝状结构。金黄色葡萄球菌（S.aureus）表现出活性NET形成，而铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）则诱导大量DNA释放，呈现云雾状形态，且与LL37共定位，提示为自杀性NET形成。采用双密度梯度法可获得高纯度和高活力的中性粒细胞。

我们提升洗涤过程的精细程度，以避免对其结构造成损伤。通过该方法，我们能够分析物质或细胞对NET形成的影响，以及它们是否参与了某些机制，或其在自身免疫性疾病治疗中的应用。