肾小球的分离与 体内 肾小球细胞表面蛋白标记

该方法有助于解答肾脏病学领域中的关键问题，即细胞表面蛋白转运在蛋白尿性和非蛋白尿性肾脏疾病中的作用。该技术的主要优势在于，它能够促进在体内研究细胞表面蛋白的转运过程，并且每次实验可同时分析多种蛋白。尽管该方法可用于探究肾小球细胞表面蛋白的转运，但也可应用于其他可通过灌注并能通过分离技术获取的器官系统。

首先确认小鼠对脚趾夹捏无反应，然后用70%异丙醇对麻醉后小鼠的腹侧进行消毒。从骨盆至胸骨沿中线切开皮肤，用镊子将皮肤从腹部筋膜上剥离。在腹部正中线两侧切开皮肤，并从膀胱至剑突处沿中线切开腹肌层。

使用剪刀和镊子将肌肉分为四个象限，并用两把手术钳将上方两个象限固定至动物颈部。将动物置于解剖显微镜下，用无菌棉签移开内脏器官。使用精细剪刀剪断肝膈韧带。

使用精细的外科镊子，在肾动脉的肝肠系膜动脉分支周围放置一根缝线。并在肾动脉上方靠近肾上腺处的主动脉周围放置另一根缝线。游离远端主动脉，使其脱离筋膜、脂肪及其他组织。

然后，在分叉水平夹闭下腔静脉和主动脉，并在肾动脉远端的主动脉周围放置另一根缝线。用镊子收紧近端主动脉缝线以减缓血流，随后在肾动脉远端的主动脉壁上剪一个直径约为主动脉一半的小孔。将连接有10 mL注射器（内含5 mL预冷的含钙镁磷酸盐缓冲液PBS）的10厘米导管插入主动脉。

用预先准备好的结扎线固定导管。然后以每分钟2毫升的流速开始灌注肾脏。使用精细剪刀在肾动脉处的肾静脉上剪开一个小孔，并收紧缝线结扎肝动脉和肠系膜动脉。

当全部体积的 PBS 完全灌注后，将灌注液更换为 5 毫升冰冻 PBS（含钙和镁），并补充 0.5 毫克/毫升生物素用于表面标记。继续以每分钟 2 毫升的流速灌注肾脏。当全部体积灌注完毕后，将含有 5 毫升冰冻 PBS（含钙和镁）并补充 100 毫摩尔/升甘氨酸的注射器连接至导管。

以每分钟2毫升的流速，用全部5毫升甘氨酸溶液灌注并淬灭肾小球。随后，以每分钟2毫升的流速，用5毫升冰冻含钙镁PBS缓冲液进行肾脏灌注，该缓冲液每毫升中添加200 µL磁珠。肾表面可见棕褐色磁珠对肾小球的栓塞现象。

当所有珠子都输送完毕后，去除肾脏的包膜，并在肾门处摘取肾脏。将肾脏置于一个含有15毫升含钙和镁的PBS的10厘米细胞培养皿中。使用新的双刃刀片将肾脏切成尽可能小的碎片。

将组织转移至含有1毫升胶原酶A的2毫升离心管中，在37摄氏度条件下孵育30分钟，孵育前后使用经改造的1000微升移液枪头轻轻混匀组织悬液。孵育结束后，将消化后的组织通过100微米细胞筛网过滤。使用细胞刮刀和预冷的含钙、镁离子的PBS冲洗残留组织，使其通过细胞筛网。

用预冷的含钙和镁的 PBS 将肾脏单细胞悬液终体积补至 50 毫升，通过离心收集肾脏细胞。弃去上清液，然后在旋涡振荡的同时，用略少于 1.5 毫升的预冷含钙和镁的 PBS 重悬沉淀，并将肾小球悬液转移至一个新的 2 毫升离心管中。为洗涤肾小球，将离心管置于磁铁上，使肾小球聚集。

一分钟后，使用1000 µL移液器吸出上清液，并将离心管从磁铁上取下。向组织中加入1 mL含钙和镁的PBS缓冲液。

用移液器将肾小球上下吹打一次，并涡旋细胞。将离心管放回磁力架，再次按上述方法洗涤肾小球，直至在40至100倍光学显微镜下分析确认样品纯度达到至少90%。

然后通过离心收集磁珠纯化的肾小球。为达到超过95%的纯度，需如图所示彻底洗涤肾小球。生物素灌注可实现生物素标记的小鼠肾脏毛细血管环的有效标记，而在未受控灌注的小鼠肾脏中则无法实现。

对肾小球提取物的生物素组分进行免疫沉淀显示，肾小球跨膜蛋白nephrin和podocalyxin可与生物素组分共沉淀，但不与对照组分共沉淀。使用链霉亲和素对免疫沉淀组分进行染色，进一步证实了在经生物素灌注动物的肾小球中存在生物素标记的nephrin，而在对照灌注动物中则无此现象。内皮细胞蛋白血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin）和细胞间黏附分子2（intracellular adhesion molecule two）也存在于生物素组分的免疫沉淀物中。

在肾毒性肾炎的早期阶段，与对照组动物相比，肾毒性肾炎动物的肾小球足细胞表面nephrin的表达水平降低。事实上，密度分析显示，与对照组相比，肾毒性肾炎动物中生物素标记的nephrin显著减少。对总nephrin与肌动蛋白（actin）比值的定量分析表明，对照组与肾毒性肾炎小鼠之间无显著差异。

此外，在中毒性肾炎和对照组动物中观察到足细胞数量相等。在晚期中毒性肾炎中，中毒性肾炎动物表现出nephrin表达的恢复，对照组与中毒性肾炎小鼠之间测得的细胞表面nephrin无显著差异，但中毒性肾炎动物总体总nephrin有所减少。此外，与对照组动物相比，足细胞数量减少。

在进行该操作时，必须注意在连接注射器的过程中确保无气泡，以避免肾小球发生空气栓塞；同时，一旦开始肾脏灌注，所有操作均需在冰上低温条件下进行。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如提取肾小球的RNA和蛋白质，以研究健康与病变肾脏中蛋白质的表达水平或相互作用等问题。