用于超微结构完整细胞中膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

该方法能够对膜蛋白进行染色，同时保持膜的完整性和亚细胞结构，因此在精确定位膜相关蛋白方面具有很强的优势。该技术的主要优点在于，它将一种稳定且可遗传克隆的标签 APEX2 与最先进的细胞保存电镜技术（包括冷冻固定和冷冻置换）相结合。

上述方法可实现对保存完好的细胞内蛋白质精确定位。该方案可用于解析病毒在宿主细胞内复制的机制。在感染过程中，病毒常会劫持宿主蛋白以协助自身增殖。

病毒拥有较小的基因组，它们利用这些基因组在宿主细胞内进行复制。最近，我们通过尚未发表的数据，利用该技术对这些蛋白质进行标记，以了解病毒的复制机制。该技术在最近一项关于导致高尔基体破裂的细菌毒素的协作研究中发挥了关键作用。

通过使用cryoAPEX技术，我们能够精确定位毒素与高尔基体碎片之间的关系，而这一点若使用常规免疫荧光技术则极难观察到。本实验技术将由本实验室的研究生艾莉诺·米赫尔克（Elaine Mihelc）和研究助理斯蒂芬妮·安吉尔（Stephanie Angel）进行演示。在培养皿中接种HEK293细胞后，按照制造商的说明，使用转染试剂将APEX2标记的哺乳动物表达质粒转染至细胞中。

转染后12-15小时，用PBS洗涤细胞一次。然后用PBS将细胞从培养皿中冲洗至15毫升锥形管中。在500 × g条件下离心5分钟。

小心吸去上清液，并将沉淀重悬于 2 毫升含 2% 戊二醛和 0.1 摩尔/升二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）的溶液中，室温下进行。将样品置于冰上孵育 30 分钟。随后，在 4 摄氏度下以 500 × g 离心 5 分钟，收集沉淀。

将沉淀物用2毫升0.1摩尔的卡考基酸钠缓冲液在4摄氏度下离心，每次5分钟，共洗涤3次。离心后，弃去上清液。为进行过氧化物酶反应，将沉淀物重新悬浮于3毫升DAB溶液中，洗涤后在500 × g离心5分钟，形成沉淀。

然后，将沉淀重悬于3毫升含5.88毫摩尔过氧化氢的DAB溶液中。室温孵育30分钟。沉淀物明显变为棕色，表明存在不溶性DAB反应产物。

根据文稿要求，用DMEM中的二甲基砷酸钠缓冲液再次洗涤后，将细胞沉淀重悬于500 µL含有10%胎牛血清和15%牛血清白蛋白的DMEM冷冻保护剂溶液中。将细胞悬液转移至0.5 mL微量离心管中。再次离心收集沉淀，离心速度略高于500 × g。

弃去大部分上清液，确保留下足够的液体，以免沉淀干燥。使用实验室擦拭纸或纸巾的一角吸去细胞沉淀中残留的液体。保留足够液体，使沉淀形成类似牙膏状的糊状物。

吸取两到三微升细胞沉淀，将其滴加到膜载体上。将膜载体的孔完全填满，使表面张力在顶部形成轻微的穹顶状。将膜载体推入卡盒中，并固定好。

将样品盒放入已准备并预冷的高压冷冻仪中，按下启动键进行冷冻。保持样品盒浸没在液氮中，将膜载体从样品盒中取出，放入塑料胶囊内，再将塑料胶囊置于装满液氮的冻存管中。

在化学通风橱中，于 Cryovial 管中为每个样品配制一毫升溶液，该溶液由 0.2%（重量/体积）单宁酸和 5% 去离子水溶于丙酮中组成。将其置于液氮中冷冻。将冻 substitution 混合液分装至一个离心管中，并将含有冷冻细胞沉淀的 Cryovial 管一同放入冷冻置换装置的样品室中。

将含有膜载体的内层胶囊从液氮小瓶转移至含有冻置换混合液一的相应小瓶中。在90摄氏度下启动冻置换程序。24小时后，暂停冻置换，用已冷却至90摄氏度的丙酮洗涤样品三次，每次五分钟。

接下来，在通风橱中，于 Cryovial 管中为每个样品配制 1 毫升固定液，其中含 1% 四氧化锇、0.2% 醋酸铀酰，并用 5% 去离子水溶解于丙酮中，随后将其置于液氮中冷冻。将含有冻替溶液二的 Cryovial 管放入冷冻置换仪中，并将第三次丙酮清洗后的胶囊转移至冻替溶液二的管中。在 -90°C 下孵育 72 小时，随后在 12–18 小时内逐步升温至 0°C。

将温度保持在 0 °C，加入预冷的丙酮清洗离心管，每次 10 分钟，共清洗三次。根据生产商说明，在塑料烧杯中配制所需树脂混合液，并将 2%、4% 和 8% 的树脂分别加入离心管中以浸没胶囊。在 0 °C 下每次孵育两小时，共孵育三次。

然后，在室温下分别用仅含A、B和D组分的15%、30%、60%、90%和100%树脂溶液各孵育4小时。20小时后，配制含有树脂组分A、B、C和D的混合液，并孵育4小时。将细胞沉淀面朝上的膜载体放入平底包埋模具中，并用A、B、C和D树脂混合液填充。将模具置于烘箱中，在60°C下聚合24–36小时。

聚合完成后，将样品块从模具中取出，并将其置于超薄切片机的垂直卡盘中，以便在放大条件下进行观察。通过在膜载体上滴加液氮使金属与塑料分离，同时使用剃刀刀片剔除膜载体周围的树脂，从而将膜载体与样品块分离。分离后，轻轻移去膜载体，使细胞沉淀物的穹顶状结构保留在样品块表面。

将细胞沉淀面朝上的包埋块放入一个比第一个包埋模具稍深的平底包埋模具中，并加入树脂组分 A、B、C 和 D。在 60 摄氏度下聚合 24–36 小时。使用剃刀片在细胞沉淀周围修块。然后将包埋块置于超薄切片机切片臂的样品夹中。

使用玻璃刀或金刚石刀将包埋块修成梯形，紧密包围细胞团块。用玻璃刀或金刚石刀获取细胞团块的90纳米超薄切片。将切片条带捞于透射电镜载网上。

用滤纸轻轻蘸去载网边缘的液体以干燥载网，并将其存放在透射电镜载网储存盒中。将载网安装到透射电镜样品 holder 上，并将 holder 放入显微镜中。使用 Tecnai T12 于 80 千伏电压下对 cryoAPEX 样品进行筛选。

利用 APEX2 标记获取目标细胞及亚细胞结构的图像。本研究中，采用传统 APEX 方法制备样本，可清晰标记出有序的光滑内质网结构。在高倍放大下，堆叠的膜结构呈现褶皱状，同心膜密度之间存在不均匀的间隙，表明膜结构保存不良以及脂质被提取。

通过cryoAPEX制备的样品也显示出对有序、光滑的内质网结构具有清晰明确的标记，但膜结构平滑且呈平行排列，几乎未见脂质提取现象。对90纳米超薄切片的透射电子显微镜（TEM）分析显示，亨廷顿酵母相互作用蛋白E存在于周边内质网以及核膜中。此外，该蛋白的密度在内质网腔侧膜上呈现出规律分布的焦点结构。

在使用传统固定和脱水方法制备的样品中，也可观察到亨廷顿酵母相互作用蛋白E的分布和焦点结构。然而，该样品存在广泛的膜结构破坏和成分提取，导致其质量欠佳。APEX2标记实验使用了三种细胞标记物，其中mito-V5-APEX2仅对线粒体产生特异性染色，而CAAX-APEX2仅对质膜产生清晰的染色。

在细胞内细胞器中未观察到标记信号。高尔基体腔的染色也如我们先前的Sengupta等论文所述，使用Alpha MAN2-APEX2标记物进行评估。通过该方法处理后，可进一步开展三维成像技术，如电子断层扫描或聚焦离子束扫描电子显微镜，以研究目标蛋白的三维分布情况。

本方案中使用的多种化学试剂具有毒性，因此在使用前应查阅安全数据表，确保采用适当的个人防护装备操作这些化学品，并根据机构规定进行处置。