一种用于识别与应激暴露相关表观遗传变化的大鼠甲基化测序平台

该方法可通过展示如何设计和实施基于测序的技术来评估环境因素对DNA甲基化的影响，从而帮助解答表观基因组学领域的关键问题。该技术的主要优势在于，与基于芯片的平台相比，它能够提供一种更全面、更定量的方法来评估DNA甲基化水平。该技术的应用意义在于，可拓展用于识别在基因组序列数据可获得的任何生物体中，由不同类型生理过程引起的DNA甲基化变化。

尽管该方法可用于研究应激对DNA甲基化的影响，但也同样适用于其他环境因素或生理状况，例如高脂饮食中环境毒物的暴露，以及糖尿病和心血管疾病等状况。在将DNA片段化并通过生物分析仪验证其片段大小后，向每个样本中加入180微升DNA结合磁珠，在室温下孵育5分钟。将磁珠置于磁力架上沉淀，弃去上清液。

将沉淀重悬于200微升70%乙醇中。接着，使用磁力架沉淀磁珠，并尽可能吸除乙醇。将磁珠置于37摄氏度的加热块中干燥三至五分钟。

然后，将沉淀重悬于44 µL无核酸酶的水中，并收集约42 µL上清液。连接接头后，通过生物分析仪验证连接效果，随后将样品转移至低DNA吸附的微量离心管中。接着，使用加热真空浓缩仪将样品体积浓缩至低于3.4 µL。

此后，向每个样本中加入 5.6 µL 的 Methyl-Seq 阻断混合液，并在热循环仪中孵育。根据文本方案配制捕获文库杂交混合液。然后，向每个样本中加入 20 µL 捕获文库杂交混合液，在 65 °C 下孵育 16 小时。

在孵育即将结束时，准备链霉亲和素磁珠：将每份样本50微升的链霉亲和素磁珠加入新的八联管中。用200微升Methyl-Seq结合缓冲液洗涤磁珠。将八联管置于磁力架上，移除磁珠上方的上清液。

然后，将磁珠重悬于200微升Methyl-Seq结合缓冲液中。将样品加入经洗涤的链霉亲和素磁珠中，在室温下于旋转混合仪上孵育30分钟。在样品混合的同时，将200微升Methyl-Seq洗涤缓冲液二等分至96孔板的三个复孔中，并预热至65摄氏度。

样本孵育后，使用磁力架沉淀磁珠并移除上清液。随后，将磁珠重悬于200 µL Methyl-Seq洗涤缓冲液一中。室温孵育15分钟，再用磁力架去除上清液。

此后，将磁珠沉淀重悬于 200 µL 预热的洗涤缓冲液二中。然后，在使用磁力架沉淀磁珠前，将磁珠置于热循环仪中孵育。向洗涤后的磁珠中加入 20 µL 甲基化测序洗脱缓冲液，并在室温下孵育 20 分钟。

使用磁力架沉淀磁珠，并将上清液转移至新的条形管中。首先，向先前收集的上清液中加入130微升亚硫酸氢盐转化试剂。将150微升的反应体系均分为两个孔。

然后，将反应物置于热循环仪中孵育。使用600 µL结合缓冲液将样品与离心柱结合，并用100 µL洗涤缓冲液洗涤离心柱。随后离心离心柱，并弃去穿流液。

此后，向各柱中加入 200 µL 脱磺化缓冲液。将柱子在室温下孵育 15 至 20 分钟。用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤柱子两次。

然后，向柱中加入 10 µL 洗脱缓冲液。在室温下孵育，并进行离心。根据文本方案配制 PCR 反应主混合液。

然后，向每个样品中加入82微升的预混液，并将样品放入热循环仪中孵育。首先，根据文本方案在冰上配制PCR预混液二。然后，向每个样品中加入25.5微升PCR预混液二和5微升商业索引引物，并将样品放入热循环仪中孵育。

使用生物分析仪上的高灵敏度DNA检测试剂评估样品的DNA浓度。随后将Methyl-Seq文库提交至下一代测序仪进行测序。在完成亚硫酸氢盐转化和PCR扩增验证样品后，使用结合缓冲液、水和链霉亲和素包被的Sepharose珠配制主混合液。

然后，向96孔板中加入75微升主混合液和5微升巢式PCR产物，并将该板置于板式振荡器上振荡15至60分钟。在振荡过程中，向焦磷酸测序分析板的各孔中加入12微升引物。振荡结束后，将真空工具放入盛有水的槽中，随后将其置于含有结合反应液的板中。

接下来，将真空工具浸入装有70%乙醇、氢氧化钠和Tris-乙酸盐缓冲液的半满槽中。断开真空，将真空工具放入HS焦磷酸测序分析板中以转移珠子。将板置于加热块上，在80摄氏度孵育两分钟。

最后，在开始焦磷酸测序程序前，让样品板冷却五分钟。本方案中，甲基化测序文库的分析提供了应激与非应激动物之间差异甲基化区域（DMRs）的排序列表，并给出了DMRs的图形化图谱。通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序验证发现，所有应激动物在全部CpG位点的甲基化水平均高于非应激动物。

CpG 10 位点的甲基化水平还与每只动物的平均三周 CORT 水平进行了比较。结果表明，内分泌数据与甲基化数据之间存在适度的相关性。在进行该实验操作时，需注意比较 DNA 片段化与接头连接步骤之间平均 DNA 大小的增加情况，并确保测序前文库数量充足。

采用此方法后，还可实施其他类似方法以回答新的科学问题，例如环境毒物对大鼠神经发育的影响。该技术建立后，为表观遗传学领域的研究人员提供了研究工具，可用于在任何基因组序列已知的模式或非模式生物中分析全基因组范围的DNA甲基化变化。请注意，操作温度敏感性酶时必须在使用过程中置于冰上，并在使用后保存于-20 °C冰箱中。

用于目标捕获的RNA磁珠在使用过程中需在冰上融化并保存，长期储存则需置于负80度冰箱中。