DNA甲基化的样本制备到生物信息学分析：肥胖及相关性状研究的关联策略

大规模组学技术正越来越多地应用于肥胖相关研究。表观遗传学可能成为暴露因素与健康结局之间的联系纽带。此类研究会产生海量数据。

鉴于此，标准化实验方案以确保数据在技术上具有可比性显得尤为重要。在本研究中，我们将提出一套用于获取和分析DNA甲基化数据的流程。该同一方案可同时适用于400K和epic版本。

第一天：亚硫酸氢盐处理。首先使基因组DNA变性，然后加入转化试剂。必须遵循试剂盒的使用说明。

用亚硫酸氢盐处理变性的DNA，然后将样品放入热循环仪中孵育。使用洗涤缓冲液进行洗涤步骤。

第二天：甲基化检测后的扩增，手动操作方案。将杂交炉预热至37摄氏度，并等待温度平衡。向板的各孔中加入20微升MA1。

将4 µL DNA转移至平板上对应的孔中。向平板各孔中加入4 µL氢氧化钠溶液。用塑料封膜密封平板。

涡旋混匀反应板，使试剂与样品充分混合。室温孵育10分钟。每孔加入68 µL RPM，然后不移除先前液体，直接加入75 µL MSM。

使用新的密封膜覆盖板。将板涡旋震荡一分钟。在37摄氏度的杂交炉中孵育20至24小时。

第三天：甲基化检测后的杂交步骤，手动操作方案。将酶标板放入37摄氏度的恒温块中预热。小心地从杂交炉中取出酶标板。

脉冲离心反应板。移除反应板上的密封膜。向每个样品容器中加入50 µL FMS。

将平板涡旋混匀一分钟。如有需要，对平板进行离心。然后将密封的平板置于37°C的加热块上孵育一小时。

向每个含有样品的孔中加入 100 微升 PM1。重新密封培养板。将培养板涡旋振荡一分钟。

在37摄氏度下孵育五分钟。然后在离心机中脉冲离心一分钟，再向每孔样品中加入300 µL的100%异丙醇。再次密封培养板。

通过翻转平板至少10次以混匀所有内容。在4°C下孵育30分钟，然后在4°C下离心20分钟。从平板上移除密封膜。

迅速将培养板倒置在合适的位置，弃去上清液。用力轻敲数次，直至观察到所有孔中均无液体残留。在室温下，将培养板倒置且不加盖，静置一小时。

干燥所有液体后，必须观察到孔底部有蓝色小点。然后向每孔加入 46 µL RA1。将热封膜封于板上。

用力按压以确保封膜均匀。将酶标板置于48摄氏度杂交炉中孵育1小时，随后涡旋震荡1分钟。短暂离心，再将酶标板在95摄氏度加热1小时。

同时准备微珠芯片杂交室。在下一步中，将400微升PB2分散到杂交室的储液槽中。在用PB2填充杂交室储液槽后，立即盖上盖子。

小心地将每份样品从孔板中加载到微阵列的样品入口。将含有微阵列的杂交室插件装入杂交室中。以交叉方式关闭杂交室，以避免杂交室可能发生移位。

第四天：甲基化检测后的染色，手动操作步骤。过夜孵育后，将所有微阵列从插入物中取出，并轻柔缓慢地清洗微阵列，总共上下清洗10次。

将微阵列转移至PB1容器二中，上下重复10次。将流动池的框架放置到正确位置，然后放置每张微阵列。在每张微阵列的顶部使用一个透明垫片。

需要将对齐条放置在对齐附件上。然后将玻璃背板放在垫片上方。接着将金属夹具固定到流室上。

使用剪刀修剪流室垫片的两端。将带有微阵列的流室放入室架中。用移液器加入150微升RA1。

孵育30分钟，重复五次。移取450微升XC1，孵育10分钟。移取450微升XC2，孵育10分钟。

用移液器吸取200微升TEM。孵育15分钟。用移液器吸取450微升95%甲酰胺。

孵育1分钟，重复2次。孵育5分钟。用移液器加入450微升XC3。

孵育一分钟，然后重复。在此步骤中，将加入以下试剂：250 µL STM、450 µL XC3 和 250 µL ATM。按照以下重复方案操作。

完成所有重复步骤和孵育后，将微阵列放置于直立架上，并将其浸入洗涤容器中，缓慢轻柔地上下移动10次。使用真空干燥器干燥微阵列，时间为50至55分钟。

微阵列干燥后，即可使用扫描仪对微阵列进行成像。在此图中，我们可以看到所使用的所有实验流程，从参与者的选择到甲基化实验最后一天获得的IDAT文件的处理。这些文件被转移至计算机，用于进行生物信息学分析。

使用 R Studio 和 Bioconductor ChAMP 软件包进行数据分析。请确保您的计算机至少具有 8 GB 的内存。还进行了其他生物信息学分析，例如基因富集分析，以更好地向读者展示数据。

在此表格中，我们可以观察到本研究使用的两组人群：肥胖组和非肥胖组。两组在体重指数、腹部周长、脂肪质量（千克）和脂肪质量百分比等变量上均存在差异。通过观察本图所示的方案，我们能够确认所提出的实验方案适用于我们的数据。

生物信息学分析后，经过筛选共保留了 409,887 个探针。密度图显示所有样本的 beta 分布密度相似。根据该分析结果，未排除任何样本。

对标准化数据进行的奇异值分解分析显示，体重指数（BMI）、双C和体脂率（FM）显著影响了DNA甲基化数据的变异性。细胞类型估算结果显示，肥胖女性体内的自然杀伤细胞（NK细胞）和B细胞比例均较高。在进行细胞类型校正前后，肥胖与非肥胖女性之间的DNA甲基化水平均存在差异。

校正前，共观察到 43,463 个不同的甲基化位点。校正后，仍有 3,329 个 CPG 位点具有显著差异。与非肥胖者相比，肥胖者中共有 162 个 CPG 位点呈低甲基化，576 个位点呈高甲基化。

数据可在 GEO 数据库中获取，注册编号为 GSE166611。我们展示了与小血管病（SVD）中观察到的参与者特定特征相关的 CPG 位点。对于脂肪量，共发现 13,222 个 CPG 位点。

在启动子区域中有 6,159 个与脂肪量相关的 CPG 位点，其中 470 个为低甲基化，94 个为高甲基化。与这些位点相关的基因已进行富集分析，结果如图所示。

我们观察到，该方案能够识别您的甲基化模式，并且能够关联您的甲基化特征。我们的结果证实，促肥胖的生活方式可导致人类DNA中的表观遗传改变。