一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡
2022年6月23日
本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。
这是一种简单且高效的方案，用于从间充质干细胞中分离和浓缩小型细胞外囊泡。该技术易于在大多数实验室中采用，因其为台式规模操作，仅需使用常规仪器即可完成。为了分离小型细胞外囊泡，我们建议大规模培养细胞，以获得至少一亿个细胞。
尽管听起来简单，但该技术的某些关键步骤通过视觉演示才能更好地理解。我们希望研究人员能够从我们的经验中学习，并有信心地掌握这些技能。我们的博士生陈宏浩先生将指导您完成间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的分离与表征经验。
首先，在4°C条件下，以200g离心培养基5分钟，以去除细胞碎片。收集上清液，并通过0.22微米滤膜过滤，以去除大于220纳米的颗粒。向离心过滤装置中加入30毫升经0.2微米滤膜过滤的磷酸盐缓冲液。
然后在4°C条件下，以3,500×g离心力离心离心过滤装置5分钟。弃去滤液收集杯中的溶液。向离心过滤装置中加入70毫升过滤后的条件培养基，在4°C条件下以3,500×g离心力离心该装置。
弃去滤液杯中的溶液。加入30毫升过滤的磷酸盐缓冲液，在4°C条件下以3,500g离心过滤单元。在滤器单元上安装浓缩收集杯，并在4°C条件下以1,000g反向离心两分钟，以获得纯化的小细胞外囊泡。
通过0.22微米注射器滤器过滤小细胞外囊泡。将样品转移至新管中，并在-80摄氏度下保存以用于后续分析。开始纳米颗粒追踪分析前，用过滤后的磷酸盐缓冲液稀释分离自人脐带来源的间充质干细胞的小细胞外囊泡，使其浓度达到每帧20至100个颗粒。
使用1毫升一次性注射器将1毫升稀释后的样品加入抗-A腔室中。相应地设置测量参数。将相机水平调节至14级。
每次测量时，点击标准测量并相应设置稀释度。接着，点击“Capture”（采集）、“Start Camera”（启动相机），并将相机水平设置为14，以观察小型EVs。要开始测量，点击“Create”（创建），然后点击“Run Script”（运行脚本），并选择文件需要保存的位置。
输入样品的必要信息，然后点击“确定”。点击设置“确定”以继续运行程序，再点击“确定”开始测量。测量记录完成后，使用五的检测阈值进行结果分析，以包含每帧10至100个红色十字。蓝色十字的数量则限制为五个。
单击“设置确定”以继续执行脚本并启动分析。在脚本完成通知窗口中单击“确定”，然后单击“导出”以将数据导出至指定位置。使用预冷的放射免疫沉淀法裂解缓冲液裂解人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡，并在4°C条件下孵育30分钟。
在4°C、200g条件下离心5分钟后收集上清液。使用BCA法测定蛋白质浓度。按要求组装凝胶电泳装置，并在90伏电压下进行凝胶电泳，直至蛋白质到达浓缩胶的末端。
将电压调至200伏，使蛋白质在分离胶中电泳至其底部。采用半干式转膜法，在15伏条件下电转1小时，将蛋白质从凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜上。在摇床上，用含0.1%吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水配制的3%牛血清白蛋白溶液室温封闭PVDF膜1小时。
将PVDF膜与一抗在4°C条件下孵育过夜，同时持续振荡。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜五次，每次五分钟，随后在室温下加入二抗，振荡孵育一小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜五次，然后使用化学发光检测试剂，在电荷耦合成像仪中显影观察膜上的信号。
使用 ImageJ 软件分析蛋白质的表达水平。首先，在 ImageJ 中打开图像文件。通过调整亮度和对比度来提高图像质量。
调整图像，直至条带清晰可见。点击“应用”按钮，并将图像以 TIFF 格式保存。对于基于透射电子显微镜的分析，取一份人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡样品，加入四份过滤的磷酸盐缓冲液，稀释至总体积为 10 µL，然后在覆有碳膜的铜网上孵育 15 分钟。
使用实验室擦拭纸去除多余的样品，并静置空气中干燥三分钟。加入10微升1%磷钨酸溶液，孵育三分钟以对样品进行染色。用实验室擦拭纸去除多余的1%磷钨酸溶液，再于空气中干燥三分钟，随后用于透射电子显微镜成像。
人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡的粒径众数为53纳米，其他显著的粒径峰分别为96纳米和115纳米。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测得的人脐带来源间充质干细胞小细胞外囊泡浓度为每毫升7.75 × 10¹⁰个颗粒。采用BCA法测定的人脐带来源间充质干细胞小细胞外囊泡蛋白浓度约为80微克/毫升。
在蛋白质印迹分析中，人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡对外泌体标志物 CD9、CD81 和 TSG101 呈阳性条带，但对 GRP94 呈阴性。通过透射电子显微镜观察分离得到的人脐带来源间充质干细胞小细胞外囊泡，以确定其大小和形态。人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡大小约为 100 纳米，呈杯状双层膜结构。
随着该实验方案的成功开发，我们现在能够揭示间充质干细胞来源的小细胞外囊泡在再生医学中的治疗潜力。
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概述
本方案概述了一种从人脐带来源的间充质干细胞（hUC-MSCs）中分离小细胞外囊泡（sEVs）的简便且高效的实验方法。本研究采用常规台式实验技术，可在多种实验室条件下轻松实施，从而有效表征sEVs的粒径、蛋白浓度及形态学特征。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞外囊泡分离
- 干细胞生物学
- 间充质干细胞
背景
- 了解小型细胞外囊泡对于评估其生物学功能至关重要。
- 人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）因其具有再生特性，是获取此类囊泡的有前景来源。
- 传统的小型细胞外囊泡（sEVs）分离方法通常需要复杂的设备，可能并非所有实验室都能获得。
使用的方法
- 台式离心用于初步分离
- 纳米颗粒跟踪分析（NTA）用于表征囊泡大小
- 蛋白质印迹和透射电子显微镜用于评估蛋白质含量和形态
主要结果
- 分离得到的sEVs平均粒径为53 nm，在96 nm和115 nm处有明显的峰。
- 通过BCA蛋白定量法测定，分离得到的sEVs蛋白浓度约为80 µg/mL。
- 证实了该方案在制备高质量sEVs以用于下游应用方面的有效性。
结论
- 该研究提出了一种从人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）中分离sEVs的可行且可调整的方案。
- 该方法可推动对sEVs在多种生物学背景下功能作用的进一步研究。
常见问题
行业重要性概述
高效分离和表征人源间充质干细胞（hUC-MSCs）来源的小细胞外囊泡（sEVs）对于推动再生医学和细胞治疗研究的发现阶段至关重要。该台式过滤方案可实现可扩展且可重复的sEV制备，支持可靠的靶点验证及后续转化研究。该方法操作便捷，定量输出明确，有利于在多个研究项目中广泛采用并实现跨项目间的可比性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在与疾病相关的系统中探究小细胞外囊泡（sEV）介导的信号通路。
- 通过提供标准化的小细胞外囊泡（sEV）制备物用于机制研究，支持功能靶点的验证。
- 有助于提高在sEV相关生物标志物发现及通路风险评估中的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 为检测方法开发和化合物筛选提供可重复、特征明确的小细胞外囊泡（sEV）样本。
- 为下游生物检测中的定量读数标准化输入材料。
- 与基于超速离心的分离方法相比，提高了可扩展性和通量。
转化与临床前研究
- 符合 MISEV 2018 标准，支持转化研究的连续性及监管要求。
- 实现小细胞外囊泡（sEV）在临床前模型研究和生物标志物一致性分析中的稳定表征。
- 降低生物学变异性，提高基于风险调整的推进决策的可靠性。
流程与工作流整合
这种台式过滤方法可融入从发现到临床前研究的连续流程，为小细胞外囊泡（sEV）的分离、定量和表征提供标准化的工作流程。
- 发现生物学：通过分离功能相关的sEV，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可直接用于检测、定量明确的sEV样本，支持可重复的筛选实验。
- 分析：支持纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量，以及通过Western印迹和透射电子显微镜（TEM）进行标志物验证。
- 转化研究：确保sEV的质量和表征从早期发现到临床前验证阶段的一致性。
- 企业级复用：提供可扩展且灵活的实验方案，适用于多样化的研发项目及跨团队标准化。
运营与企业影响
- 科学价值：提高sEV研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：利用易于获取的仪器实现sEV分离流程的简化，并具备高度可重复性。
- 战略价值：通过标准化sEV工作流程，支持更优的“推进/终止”决策，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的优先级排序，推动sEV相关治疗项目的进展。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、过滤和囊泡表征技术方面的专业知识。
- 需要配备台式离心机、纳米颗粒追踪分析仪以及Western blot/透射电镜（TEM）相关基础设施。
- 要求跨团队就小细胞外囊泡（sEV）的表征标准和定量阈值达成一致。
- 通过优化实验方案，可适用于多种干细胞来源及条件培养基。
- 得率和纯度可能随起始细胞数量和过滤参数而变化，需进行经验性调整。
