MCF7细胞单层中细胞-基质黏附面积与细胞形态分布的量化分析

本方案可实现从细胞内结构的二维图像中对其面积、周长和形态进行定量分析。该技术快速简便，仅需常规实验室设备和共聚焦显微镜，并使用开源软件。本实验操作由本实验室的博士研究生 Anna Balcerak 演示。

首先，在四孔胶原蛋白I型包被的腔室载玻片中，每孔加入5 × 10⁴个细胞和0.5毫升培养基，于37°C、5% CO₂培养箱中培养24小时。次日早晨，使用倒置光学显微镜确认细胞形成至少90%融合的单层，并使用共聚焦显微镜获取单个Z平面图像。进行黏着斑分析时，在ImageJ中打开图像，选择“分析”→“设置尺度”→“移除尺度”，并设为全局模式，以设定图像的像素尺度。

为了在测量选项中包含文件名和感兴趣区域的面积，请点击“analyze”（分析）并选择“set measurements”（设置测量），然后勾选“area”（面积）和“display label”（显示标签）选项。为了减去背景，请选择“process”（处理）中的“subtract background”（减去背景）。将滚动球半径设置为50像素，并勾选“sliding paraboloid”（滑动抛物面）。

为了确定最小感兴趣区域的面积，勾勒出最小的单个黏着斑，然后点击“分析”和“测量”以测定其面积。当至少选择并测量了20个感兴趣区域后，计算并保存所得结果的平均值。将上限设定为典型细胞面积的25%。

为将图像转换为二值图像，点击图像、调整、阈值，选择默认、黑白模式和暗背景。为测量感兴趣区域的数量和面积，选择分析和分析颗粒，并勾选像素单位、显示结果、清除结果和汇总。将汇总窗口中的切片、计数和总面积平均大小数据转移至所选的数据管理程序中。

进行黏着斑定量时，打开ImageJ中的黏着斑宏程序，并将最小感兴趣区域的面积作为“最小感兴趣区域面积”参数输入。将阈值类型设置为手动或自动，并保存更改。然后在ImageJ中调用该宏程序，并选择待处理的图像。

进行人工细胞形态分析时，在合适的图像处理软件中打开图像，并选择需要测量的参数。使用手绘选择工具，根据所选的连接蛋白标记的手动勾画细胞边界。每个细胞的各项选定参数将被自动计算。

当所有细胞均被勾画完毕后，选择“编辑”、“选择”和“添加到管理器”。仅应选择边界完整且完全可见的细胞。为进行测量，在兴趣区域管理器左侧框中选中所有出现的编号，然后点击“测量”。

结果将显示在结果框中，并可导入至选定的电子表格中。自动细胞分析有助于对大量细胞进行定量。针对每一种新的细胞类型，需首先运行宏程序以确定参数。

宏运行结束后，选择设置细胞大小边界。单击最小和最大细胞的标签，然后单击“测量”。设置最小细胞和最大细胞变量的数值，并保存更改。

关闭所有宏窗口，选择要以灰度处理的图像，然后再次运行宏。宏将生成一个结果表格，其中包含细胞形状指数、长宽比以及感兴趣区域选择列表的数据。

在此，可以观察到使用 ImageJ 计数的黏着斑的代表性图像，其中包括对照组和敲低细胞系的最终编号轮廓，以及黏着斑轮廓与原始图像的叠加结果。如本分析所示，与对照细胞系相比，敲低细胞每细胞的黏着施数量更多，且黏着斑尺寸更大。在这些图像中，展示了未经处理和经化学治疗处理的细胞单层的代表性区域。

根据细胞形状指数值对轮廓细胞进行表征，例如在本分析中显示，与未处理的对照细胞相比，药物处理细胞的最后一个区间值增加，主峰趋于平缓。随后可为每种细胞培养生成频率分布和累积分布。如图所示，对单层细胞进行灰度成像，实现了对来自12个视野的512个细胞的分析与定量，揭示了细胞形状指数的相对频率分布。

为了使本实验方案成功实施，使用尽可能高质量的图像至关重要。正确的细胞接种、染色和成像操作应确保获得足够实验质量的图像。