利用定量成像技术鉴别与表征异质细胞群体

本方法的总体目标是在区分亚群的同时，对异质细胞群体在受到扰动时的动态表型响应进行定量评估。大多数生理相互作用均发生在多种细胞类型共存的环境中。该方法可帮助细胞生物学家评估异质性细胞在相同环境压力下的响应方式，以及不同类型细胞之间如何相互影响。

该技术具有多项优势：可区分多种细胞类型，能够同时分析亚群，包括细胞增殖率、死亡率及形态动力学变化。尽管本方案可用于研究多种生物学过程，我们将以经厄洛替尼（一种化疗药物）处理的H3255肿瘤细胞和CCD19LU成纤维细胞为例，演示实验流程。首先，按照文本方案在离心管中制备细胞悬液后，轻轻颠倒混匀管内液体，使细胞充分混匀，以确保接种的均一性。

然后将每种细胞悬液各10微升用移液器加入微量离心管中，并加入10微升台盼蓝。取10微升该溶液加入细胞计数板，然后将计数板插入自动细胞计数仪中。至少重复细胞计数三次，或直至获得一致的计数结果。

使用多通道移液器，将总共 1,500 个细胞悬于 100 微升 RPMI 培养基中，接种至 96 孔板的各孔内。每种细胞悬液均设三个复孔，每个时间点的培养板设置应保持一致。将细胞置于培养箱中过夜培养。

将 DMSO 加入 Erlotinib 粉末中，配制 10 毫摩尔的 Erlotinib 储存液。然后使用细胞培养基将药物稀释至最高终浓度的两倍，即 10 微摩尔。以 1:10 的比例对药物进行连续四次稀释，共得到五个药物浓度梯度及一个无药物对照组。

将100微升药物溶液加入细胞96孔板的相应孔中，使药物终浓度为在培养基中稀释1倍。然后，为进行基于荧光分类的细胞染色，用PBS配制5微克/毫升的核染料和5微摩尔的死细胞染料；为进行基于形态学分类的染色，用PBS配制5微克/毫升的核染料、5微摩尔的死细胞染料以及5微摩尔的细胞染料。

向每个孔中加入 20 微升染料溶液。然后将样品在 37°C 避光孵育 30 分钟。成像前，用 70% 乙醇擦拭培养板底部，并将培养板放入成像室中。

在通道选择的设置选项卡中，点击加号按钮，将适当的通道添加到图像中。在布局选择下，设置一个z轴层叠的测试图像，每隔2微米采集一次，从0微米开始，至20微米结束，以确定焦平面。在每个通道下点击“快照”按钮，以评估信号强度并优化曝光时间。

根据需要在时间下输入更高或更低的数值。为了确保下游分析的准确性，细胞中的细胞核必须处于焦点位置。在板示意图上，标出相应的孔位。

然后在孔位示意图中，以类似方式高亮标记出需要成像的25个视野。在“运行实验”部分，于“板名称”中识别出对应的板，随后点击“开始”按钮，使用10倍物镜运行图像采集程序，以在选定通道中生成灰度TIFF图像。安装开源软件CellProfiler和CellProfiler Analyst后，打开CellProfiler，点击“文件”→“导入”→“从文件导入流程”，然后选择相应的文件。

选择基于荧光的分类流程，根据EGFP强度将细胞分类为H3255或CCD19LU，并计算形态学特征。点击“查看输出设置”，然后选择用于分析的图像文件位置以及提取数据的保存目标位置。在运行分析之前，应先在测试模式下测试该方案，以检查参数值的合理性。

细胞核和细胞的分割必须准确。本方案旨在识别具有不同细胞核染色强度的细胞，并确保用于扩展细胞核的像素值足够大，以覆盖DNA染色最强的细胞核，但又足够小，避免覆盖邻近的细胞核。为了基于荧光对群体进行分类，首先需重新调整GFP荧光强度的范围，然后测量每个已识别细胞核的GFP强度，并根据用户设定的阈值对目标进行分类。

接下来，单击“分析图像”以开始分析。分析完成后，请前往默认输出文件夹查看计算得到的数据。对于基于形态学的分类，请在 Cell Profiler 中运行相应的方案以生成全细胞形态学特征。

打开 Cell Profiler Analysis 软件，选择在 Cell Profiler 中生成的数据库属性文件，然后点击“打开”。点击屏幕左上角的“分类器”选项卡。为从实验中调用随机的细胞图像，请点击“获取”，图像将出现在未分类窗口中。

通过选择并拖动细胞至相应的分类框中，手动将细胞分为阳性或阴性，此处分别代表 H3255 或 CCD19LU。对每个亚群至少分类 50 个细胞后，点击“训练分类器”，然后点击“检查进度”。最后，点击“全部评分”以生成包含各亚群细胞计数的表格。

在H3255肿瘤细胞与CCD19LU成纤维细胞的异细胞低温培养中，根据DNA染色对细胞核进行识别和分割。细胞群体通过人工诱导的荧光信号或基于形态学差异的机器学习算法训练来进行分类。基于荧光与基于形态学的两种方法之间具有高度一致性。

两种分类方法独立应用于相同的图像，在未处理组和处理组中的一致率分别为97.4%和92.5%。本研究考察了细胞形态的变化以及对厄洛替尼（Erlotinib）治疗的反应。经过三天的药物处理后，H3255细胞的细胞核面积减小，细胞总面积增加。

这可能是由于细胞死亡所致。为了检测厄洛替尼对细胞具有细胞毒性还是细胞抑制作用，通过碘化丙啶染色来鉴定死亡细胞。结果显示，厄洛替尼对H3255细胞具有细胞毒性和细胞抑制作用，药物处理后死亡细胞数量增加，新生细胞数量减少。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在两个不连续的小时内完成。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如 RA 干扰或 CRISPR 技术，以探究功能基因组学中的更多问题。该技术建立后，为癌症生物学领域的研究人员探索间质细胞对多种癌症类型中肿瘤进展的影响铺平了道路。

观看本视频后，您应能够充分理解如何研究异质细胞对环境刺激的反应，特别是如何以高通量方式分析基于显微镜的成像数据。