基于脱细胞技术的骨骼肌脂肪浸润定量分析

我们关注的是收缩肌与在损伤和疾病过程中于肌纤维间形成的脂肪细胞（称为肌内脂肪组织，或IMAT）之间的相互作用。在细胞和小鼠中进行基因工程是深入解析脂肪与肌肉间相互作用机制的有力工具。通过转录组学和蛋白质组学分析信号传导通路可鉴定出介导因子，随后可利用基于生物材料的药物递送系统对这些通路进行干预。

其中一个主要挑战是分离和定量 IMAT 脂肪细胞。尤其是在小型动物模型中，通过转录组学或脂质组学等全肌肉分析方法会使 IMAT 信号被淹没。而通过非侵入性成像技术对 IMAT 进行定量也面临类似的信号混杂问题，因为大多数体素包含肌肉和 IMAT 的混合物。

我们最近使用本文所述技术证明，肌内脂肪组织（IMAT）会直接损害肌肉收缩功能。通过精确测量IMAT的沉积量，我们发现IMAT不仅会取代收缩性肌肉组织，还会阻碍剩余瘦肌的收缩能力。本方案针对IMAT定量过程中的挑战进行了优化。

目前测量小动物IMAT的标准方法是单切片组织学，该方法不具备全面性，而非侵入性成像技术则成本高昂且分辨率较低。我们认为这些局限性阻碍了对IMAT与肌肉之间相互作用的深入理解。本技术提供了一种全面且经济的方法，可通过定性可视化和多尺度定量分析来评估IMAT。

我们希望这种技术的简便性能够鼓励更多研究人员在动物模型中测量肌内脂肪组织（IMAT）。此外，该技术将为关注IMAT的研究人员提供一种更高精度的工具，以揭示IMAT脂肪细胞与其他细胞之间更细微的关系。首先，检查从处死的小鼠中分离出的目标肌肉，确保无骨碎片或不规则边缘；如有需要，可用锋利的剪刀将其修剪干净。

使用分析天平称量已清洗的肌肉组织，并记录其重量。按照每毫克组织至少加入0.1毫升1% SDS的比例，将肌肉组织置于溶液中，然后将孔板放置在摇床振荡器上，频率设定为50至80赫兹。定期肉眼观察SDS溶液的状态。

当溶液变浑浊时，用移液器吸除溶液，注意不要吸走肌肉组织，并加入等体积的新鲜1% SDS溶液。当溶液在24小时内保持澄清时，移除脱细胞肌肉中的最终SDS溶液，并替换为等体积的PBS。在体视显微镜下检查脱细胞肌肉，使用镊子小心去除附着在肌肉上的任何毛发或碎片。

小心吸除 PBS，并加入等体积的 3.7% 多聚甲醛，然后将培养板放回摇床上固定 24 小时。通过将 0.5 克 ORO 粉末溶解于 100 毫升异丙醇中配制 ORO 储存液。通过将 ORO 储存液与去离子水按 60:40 的比例混合，为所有肌肉组织配制工作液。

将工作液覆盖并静置10分钟，使颗粒物沉淀。先通过40微米滤网过滤，再用0.22微米针头滤器过滤。接着，从培养板中的脱细胞肌肉中移除甲醛溶液，并用等体积的PBS洗涤肌肉三次。

然后，用等体积的60%异丙醇溶液替换PBS，并在摇床上孵育5分钟。完成后，在摇床上孵育10分钟之前，将60%异丙醇溶液替换为ORO工作液。接着，用等体积的1%SDS溶液替换ORO工作液，并定期观察SDS溶液的变化。

当溶液明显变为粉红色后，将SDS溶液更换为新鲜的1% SDS。当溶液在24小时内保持澄清时，将1% SDS更换为PBS。在体视显微镜下以4倍放大倍数观察，清除附着在染色肌肉外部的任何明显碎屑或颗粒物。

如果染色效果满意，可见明亮的红色球状物悬浮于透明基质中，则使用连接在体视显微镜上的相机采集染色图像。充分去细胞化的肌肉呈白色且半透明。当去细胞化肌肉经油红O（ORO）染色以显示肌内脂肪组织（IMAT）时，IMAT脂滴在清晰的肌肉结构内表现为红色球状物。

健康小鼠后肢肌肉仅显示少量天然肌内脂肪组织（IMAT），表现为油红O（ORO）阳性脂质极少或无，相比之下，注射了心脏毒素或甘油的后肢肌肉则表现出更明显的脂质沉积。在初始SDS处理后或油红O染色洗脱后，脱细胞不完全的表现为半透明的浅粉色纤维。油红O洗脱后，若出现粉红色或红色的均匀背景，而非清晰分明的肌纤维线条，则提示油红O清除不完全。

首先，将经油红O染色的脱细胞骨骼肌转移至96孔板各孔中的200微升异丙醇中。通过轻敲培养板使溶液振荡，并在显微镜下用移液器吸头机械性碾压肌肉组织，直至脱细胞肌肉悬液中不可见红色球状物为止。随后，再次通过反复吹打混匀各孔中的细胞悬液，然后将75微升转移至该板中的两个洁净孔中。

用盖子覆盖酶标板，使用分光光度计或酶标仪读取双份75微升孔的吸光度。为开始对染色的IMAT脂滴指标进行定量分析，请在ImageJ中打开共聚焦图像序列。依次选择“图像”、“调整”、“阈值”，以打开阈值用户界面。

在用户界面中，选择“Intermodes”作为阈值类型，并确保选中“Dark background”。然后点击“Apply”以运行阈值算法。通过选择“Process”→“Binary”→“Watershed”来运行分水岭算法，以分离相互接触的脂滴。

在对话框中选择“是”，以处理堆栈中的所有图像，添加细黑线来分割大面积的纯白色区域。要设置粒子的最大和最小尺寸，请打开原始图像，使用椭圆工具标出视野中最小和最大的脂滴轮廓。然后按 T 键将这些区域添加到 ROI 管理器中，选择“分析”，然后选择“设置测量值”。

在对话框中，选择设置，勾选“仅面积”（Area only），然后点击“确定”。接着，从 ROI 管理器中选择“测量”（Measure）。使用此“结果”（Results）窗口中的两个面积测量值作为“分析颗粒”（Analyze Particles）中的尺寸范围。为了通过“分析颗粒”算法识别感兴趣区域（ROIs），请选择“分析”（Analyze），然后选择“分析颗粒”（Analyze Particles）。

打开一个对话框以设置选择参数。要输出感兴趣区域（ROI）的测量结果，请选择“分析”（Analyze），然后选择“设置测量值”（Set Measurements），并勾选“面积”（Area）、“质心”（Centroid）、“拟合椭圆”（Fit ellipse）和“堆栈位置”（Stack position）。单击“确定”（OK）。然后，从 ROI 管理器中选择“测量”（Measure）。

结果表格中的数据可被选中并复制到 Excel 中以进行进一步分析。为了对单个脂滴的测量指标和分布情况进行详细评估，通过共聚焦显微镜对 BODIPY 荧光标记的脂滴进行成像。阈值分割和形态分割为生成每个脂滴的感兴趣区域（ROI）提供了良好的初步处理方法。

然而，需要进行手动编辑以纠正错误。在图像上显示较暗的深层脂滴可通过 ImageJ 中的椭圆工具手动添加。一组被错误识别为单个 ROI 的脂滴，也可通过删除原始 ROI 并用多个新的 ROI 替代来进行校正。

当单个脂滴在多个切片中被识别为多个独立的感兴趣区域（ROI）时，这些重复的ROI将被合并为一个单一的ROI。