无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

本方案描述了如何生成多聚核糖体图谱，以揭示细胞内核糖体活性的分子细节。该技术使无法获得自动梯度分离系统的用户也能获取多聚核糖体图谱所提供的宝贵信息。在制备梯度时请耐心操作，并将梯度置于不会受到压缩机或其他机械操作干扰的位置，以确保其自然沉降形成线性梯度。

首先，配制7%和47%的蔗糖储备液于蔗糖梯度缓冲液中。使用0.22微米滤器对蔗糖储备液进行过滤除菌。通过分配并混合7%和47%的储备液，配制14毫升的17%、27%和37%蔗糖溶液。

将六个聚丙烯离心管放入一个全视型试管架中。确保管与管之间有足够的空间，以便对一根管的操作不会干扰其他管。将一根9英寸、22号规格、钝头的针头连接到3毫升注射器上，并进行试抽吸和排液，以确认注射器在设置梯度前能够容纳蔗糖溶液且无滴漏现象。

在每支离心管底部加入 2 毫升 7% 蔗糖溶液。然后，将针头尖端置于离心管底部附近，再在 7% 溶液下方加入 2 毫升 17% 蔗糖溶液。小心且缓慢地注入该溶液。

分别取 2 毫升 27%、37% 和 47% 的蔗糖溶液重复上述操作，确保每层之间有一条清晰的分界线以区分不同密度。将梯度溶液在 4 °C 下保存过夜，使其形成连续且蔗糖浓度递增的梯度。在酵母（Saccharomyces cerevisiae 细胞）生长和收获后，将细胞重悬于 700 µL 冰冷的多聚核糖体提取缓冲液中。

加入100单位的RNase抑制剂。然后，加入400微升预冷的玻璃珠，其直径约为425至600微米。将混合物连同玻璃珠一起转移至1.5毫升离心管中，并使用珠磨机剧烈振荡5分钟，以破碎酵母细胞。

裂解细胞后，通过离心澄清裂解液。使用基于荧光的RNA检测系统，通过测量260纳米处的吸光度来确定澄清裂解液中RNA的浓度。确保RNA浓度为每微升0.5至1微克。

如果RNA浓度太低，可减少用于重悬细胞的提取缓冲液体积。将裂解液小心地加至梯度液的上方。将移液器吸头紧贴聚丙烯管内壁顶部放置。

将离心管倾斜，缓慢将裂解液沿管壁滴加至梯度液顶部。轻轻将离心管放入预冷的水平转子吊桶中，进行离心。离心结束后，小心地从水平转子吊桶中取出离心管，置于试管架中。

标记96孔板用于储存组分，并置于冰上预冷。从梯度顶部开始，小心地将移液枪头插入梯度顶部，收集100或200微升的组分，直至整个梯度被分装完毕。使用分光光度计，在254纳米波长下测定每管组分的吸光度，以7%和47%蔗糖溶液作为空白对照。

通过绘制组分编号与吸光度的关系图来生成多聚核糖体图谱。图中展示了酿酒酵母（S. cerevisiae）的三个代表性多聚核糖体图谱。每个图谱中，各核糖体亚基及多聚核糖体峰的峰顶均清晰可见。

此处展示的是来自自动化密度梯度分馏系统的代表性图谱。该图谱是通过推动液从下至上将蔗糖梯度溶液推出，经检测器流动池时连续测定吸光度而获得的，并按组分进行收集。此处还展示了通过手动分馏200和100微升样品所获得的多聚核糖体图谱。

进行此操作时最重要的是避免破坏梯度。加样时需小心，避免引入气泡或因加液过快而扰乱梯度。按照本步骤操作后，可从梯度中提取RNA，用于进一步分析，以确定与活性核糖体结合的mRNA。