通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、折叠及组装途径中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析技术，这是一种用于在模式真核生物酿酒酵母（Saccaromyces cerevisiae）中直接分析这些相互作用的体内方法。迄今为止，选择性核糖体谱分析是唯一能够以直接方式在体内捕获并表征共翻译相互作用的方法。

选择性核糖体谱分析能够以接近密码子分辨率对翻译核糖体的任何因子及其相互作用进行全局分析。首先收集含有目标标签蛋白的构建酵母细胞。使用混合研磨仪在30赫兹条件下进行两次冷冻研磨裂解细胞，每次两分钟。

在4°C、30,000 × g条件下离心两分钟以澄清裂解液，并收集上清液。取200 µL上清液转移至微量离心管中用于总RNA分析，另取700 µL转移至微量离心管中用于免疫纯化。将先前分离的总RNA样品加入10单位的RNase I，在4°C、旋转混合仪上以每分钟30转的速度孵育25分钟进行消化。

按照文稿中的描述制备蔗糖垫主混合液。然后，将样品加至400 µL蔗糖垫上，于245,000 × g、4 °C条件下离心90分钟。用真空泵迅速吸除上清液，并在沉淀物上覆盖150 µL裂解缓冲液。

用石蜡膜固定样品，并在4°C、300转/分钟条件下振荡一小时，使沉淀重新悬浮。每份样品使用100至400微升亲和结合介质，用一毫升裂解缓冲液重悬亲和介质，重复洗涤三次。然后，在4°C、旋转混匀仪上以30转/分钟旋转五分钟。

通过离心沉淀。弃去上清液，并重复此过程三次。将亲和结合介质加入先前分离的免疫纯化样品中，并使用RNase I进行消化。在4°C、每分钟30转的旋转混合仪中旋转25分钟，使蛋白质与亲和介质结合。

按照文稿中的描述配制洗涤缓冲液母液。用一毫升洗涤缓冲液在混合架上旋转洗涤亲和结合介质约一分钟。随后，在四摄氏度条件下以3000 × g 离心30秒，沉淀后弃去上清液。

重复三次。每次用一毫升洗涤缓冲液洗涤五分钟，在混合架上旋转，共洗涤两次。再次通过离心沉淀。

使用50微升珠子与等体积的2倍上样缓冲液进行蛋白质洗脱。离心使珠子沉淀，弃去上清液。用700微升10毫摩尔的Tris缓冲液进行洗脱。

然后，用液氮速冻。将样品从液氮中取出，于负80摄氏度保存，用于后续RNA提取。使用各步骤的等分试样，通过Western印迹或考马斯亮蓝染色评估亲和纯化步骤的成功与否，以非标签野生型菌株的模拟免疫沉淀作为对照，排除非特异性结合到亲和基质上的情况。

亲和纯化后的蛋白质印迹结果证明了标签蛋白表达成功。通过生物分析仪结果验证了核糖体保护片段的分离。在构建用于深度测序和大数据分析的cDNA文库时，循环次数不足会导致产量偏低。

然而，由于dNTPs仍然存在，反应继续进行，导致PCR产物自我引物化，产生带有嵌合序列的较长PCR副产物。所构建的文库进一步通过高灵敏度DNA电泳验证其精确的片段大小分布及定量结果。对测序文库进行接头和条形码序列截除后，将获得的读段划分为编码序列、内含子及基因间序列等不同组别。

此处展示了Vma2p与核糖体相关分子伴侣Ssb1p、Pfk2p和Fas1p共翻译相互作用的核糖体图谱，并附有每项亲和纯化实验的设计方案。与Ssb1p、Pfk2p和Fas1p相互作用组相比，总翻译组的开放阅读框上均存在核糖体占据。此处显示了Ssb1p、Pfk2p和Fas1p在开放阅读框各核糖体位置的平均富集程度。

该方法能够鉴定和表征多种共翻译相互作用，确保蛋白质组的正常功能，同时也可用于研究多种疾病。迄今为止，选择性核糖体谱分析是唯一能够在体内直接捕获并表征这些相互作用的方法。