确定感染细胞中HIV-1逆转录过程中新生单链病毒DNA的3'-末端及其序列

这种用于分析逆转录的新方法可以让我们深入了解逆转录病毒学领域。例如，我们可以了解细胞限制因子发挥作用的具体机制，或抗逆转录病毒药物如何抑制 HIV-1 DNA 合成。该技术的主要优势在于，它不仅能提供新生逆转录产物序列的信息，还能以单核苷酸分辨率精确定位其 3' 端 DNA 末端的位置。

通过杂交捕获法从 HIV1 感染细胞的总 DNA 中富集 HIV1 互补 DNA，该操作应在 PCR 工作站中进行。通过移液将每份样本 100 µL 磁性链霉亲和素珠加入同一个微量离心管中，配制磁珠主混合液，并将该管置于适用于微量离心管的磁力架上。待磁珠向管壁的磁铁一侧沉降后，吸除储存缓冲液，将管子从磁力架上取下，并用 500 µL 结合洗涤缓冲液（Bind/Wash buffer，简称 BW 缓冲液）重悬磁珠。

将离心管放回磁力架上，等待磁珠迁移至管壁一侧后，吸除上清液。从磁力架上取下离心管，加入500 µL的酪蛋白溶液，重新悬浮磁珠，并在室温下孵育10分钟。孵育10分钟后，用BW缓冲液洗涤磁珠。

将离心管放回磁力架上，移除上清液，并将磁珠重悬于500 µL BW缓冲液中。每个样本加入50皮摩尔的捕获型生物素化寡核苷酸。在室温下于翻转混匀仪中孵育30分钟。

接下来，将离心管放回磁力架上，弃去上清液，从磁力架上取下离心管，加入500 µL的1× TEN缓冲液，重悬磁珠。第二次洗涤后，每份样品用10 µL的1× TEN缓冲液重悬带有固定化寡核苷酸的磁珠。每份样品标记一个微量离心管，加入10 µL磁珠悬液、170 µL DNA和90 µL 3× TEN缓冲液。

在92°C的干式加热块中孵育2分钟，以使DNA变性。将试管转移至另一设定为52°C的干式加热块中，孵育1小时。在此孵育期间，每10分钟颠倒试管一次，以混匀内容物。

当一小时的孵育完成后，用500 µL的1× ten缓冲液洗涤磁珠一次，并将磁珠重悬于35 µL无核酸酶的水中。在去除任何液体前，将离心管置于磁力架上约三分钟，确保磁珠充分沉降。为洗脱，将离心管置于92 °C的干式加热块中孵育两分钟。

然后，依次将离心管迅速转移至磁力架上。待磁珠吸附至管壁一侧后，将含有HIV1 DNA的上清液转移至新的离心管中。开始此操作前，用无核酸酶的水将冻干的接头重新溶解至100 µM浓度，并涡旋振荡混匀。

每个样本外加一个对照样本，加入0.45 µL的10x T4 DNA连接酶缓冲液、4 µL接头和0.05 µL无核酸酶水。在92°C加热2分钟，然后在PCR仪中缓慢冷却至16°C。此过程可使接头形成发夹结构。

该实验步骤的关键在于将适配子分子高效且无偏倚地连接至开放的3'端DNA末端。使用T4 DNA连接酶，将不同长度的纯化新生cDNA分子连接至发夹结构的单链DNA接头。该接头包含一段随机的六核苷酸条形码序列，既可配对促进连接反应，又可作为唯一读段的识别标识。

3'末端接头带有间隔序列，以防止自连。为配制终体积为60微升的连接反应体系，向每个PCR管中加入以下组分：6微升10×T4 DNA连接酶缓冲液、24微升40% PEG、6微升5摩尔甜菜碱、4.5微升接头、1.2微升T4 DNA连接酶以及18.3微升DNA。充分混匀反应体系后，在PCR仪中于16摄氏度孵育过夜。

连接接头后的第二天，向每个连接反应体系中加入含有DNA上样缓冲液的三十微升甲酰胺，用移液器吹打混匀。在PCR仪中94°C加热两分钟，然后立即置于冰上。下一步是准备进行变性凝胶电泳。

将一块预先制备的6% TBE变性尿素聚丙烯酰胺凝胶放入合适的凝胶电泳槽中，并加入1× TBE电泳缓冲液。预电泳20分钟。随后，使用注射器和21号针头用运行缓冲液冲洗凝胶加样孔。

然后将同一份样品每孔加入30 µL，分别加入三个孔中。建议每个凝胶只跑一份样品，以避免交叉污染。电泳20分钟。

在凝胶电泳进行的同时，为每个样品准备三个0.5毫升的微量离心管，使用21号注射器针头在管底刺孔。将每个处理好的小管插入2毫升的微量离心管中，并标记样品名称及“低”、“中”或“高”。当深蓝色染料前沿迁移至凝胶中部时，停止电泳并取出凝胶盒。

打开胶盒，用剃刀将凝胶垂直切割，完整切下包含三个加样孔的胶条。将胶条放入含有1× TBE缓冲液和5 µL氰化物核酸染料的容器中，孵育3至5分钟。

确保染色充分，以便于清晰识别出稍后需要切除的游离接头的顶端。接下来，使用去离子蒸馏水彻底清洁蓝光透射仪的表面。然后将凝胶条从染色容器中取出，放置在透光板上。

打开光源盒，通过橙色滤光片观察染色的核酸。此处显示的是染色凝胶上具有代表性的连接DNA样品。接头通常过载，呈大团状，而连接的HIV1 DNA则在其上方呈条带状迁移。

红色线条指示了切割凝胶的位置，以去除游离的接头，并将样品均分为三个部分。使用新的剃刀刀片，如果凝胶边缘存在未加样区域，则将其侧边切除。接着，在接头稍上方进行切割，以去除接头及下方的凝胶部分。

最后，切去凝胶最顶端部分，包括约一毫米的加样孔区域，该区域通常含有较高分子量 DNA 的强而尖锐的信号。将剩余含有样品的凝胶部分水平均分为三段：低、中、高分子量区域。

然后，将三个凝胶片段各自切成 2 × 2 毫米大小的碎块，并转移至已准备好的 0.5 毫升微量离心管中。开盖以最高速度离心 1 分钟。通过小孔将凝胶碎块挤入 2 毫升离心管中，以制成凝胶浆状物。

如果零点五毫升离心管底部仍有凝胶颗粒残留，可用针头将其手动转移至二毫升离心管中。在每个微量离心管的凝胶碎片中加入一毫升尿素凝胶提取缓冲液，开始DNA提取步骤。将离心管置于室温下，使用翻转混匀仪旋转混匀，至少三小时。

准备滤膜柱。使用一套洁净的镊子，将一个小型圆形玻璃纤维滤膜加入每个带有醋酸纤维素膜滤器的离心柱中，以防止膜堵塞。用倒置的移液管头将滤膜放置到位。

将含有凝胶碎片和提取缓冲液的2毫升离心管在微量离心机中短暂离心，然后将700 µL上清液转移至已准备好的过滤柱中。将过滤柱在微量离心机中以最高速度离心1分钟。随后，将滤过液转移至新的2毫升微量离心管中。

用剩余的上清液重新加载层析柱。尽量从提取物浆液中获取尽可能多的液体，即使包含凝胶碎片也无需担心。再次离心。

合并相同提取样品的穿流部分，并按照文中的实验方案进行后续操作。该方案应用于在有或无抗逆转录病毒人源蛋白 A3G 的情况下，感染了 Vif 缺陷型 HIV-1 的 CEMS-ST 细胞样品。各样品获得的唯一序列读长总数的图示表明，A3G 水平的升高会减少总读长数量。

反映了A3G对逆转录酶介导的cDNA合成的抑制作用。在接下来的三个图中，前182个核苷酸内每个可能长度的分子所占比例以蓝色直方图显示。加入A3G后，在少数几个特定且可重复的位置，较短的截短cDNA分子显著增加。

虚线红线显示了在相应位置携带 C 到 T 突变的读段所占的百分比。可通过处理一组已知序列、长度和浓度的合成寡核苷酸混合物来生成阳性对照。所有分子的丰度应接近相等，仅有微小差异。

如果文库测序运行在测序过程中产生轻微的长度偏差，建议应用一个由代表大小偏差斜率推导出的标准化因子。该方法可轻松适用于其他系统，在这些系统中，确定DNA分子的3'末端将有助于深入了解核酸代谢相关领域。请务必注意，操作HIV可能具有极高危险性，某些实验只能在指定的安全实验室中进行。