使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

本实验的总体目标是利用图像处理软件SPHIRE，通过电子冷冻显微镜数据的单颗粒分析来确定大分子复合物的结构。单颗粒冷冻电镜技术正成为以近原子分辨率研究大分子结构的主流技术。SPHIRE是一种新型软件包，能够以用户友好的方式实现冷冻电镜数据的半自动化处理。

SPHIRE 的主要优势在于其自动验证机制。大多数流程只需运行一次，结果即具有客观性和可重复性。高分辨率冷冻电镜可用于定位单个残基，从而为复杂大分子机器的结构与功能提供关键见解。

初次使用该方法的研究人员应牢记，获得高分辨率结构在很大程度上取决于样品质量和输入数据的质量。要开始使用 SPHIRE 软件，请从终端打开其图形用户界面。打开“工具”（UTILITIES），使用 e2display 显示冷冻电镜图像。

使用内置测量工具以埃/像素为单位测量颗粒最长轴。打开项目设置，将CTF窗口大小设置为至少等于颗粒盒尺寸。

将颗粒盒尺寸设置为偶数，至少为颗粒直径的1.5倍。将颗粒半径设置为至少等于测量长度的一半。如已知，输入点群对称性及分子质量的近似值。

注册设置。接下来，在 MOVIE 菜单中，打开显微照片电影对齐功能。设置 unblur 和 summovie 可执行文件的路径。

选择一个原始的未对齐的显微照片电影文件，并将文件名变量替换为通配符以设置输入显微照片的路径模式。命名输出目录。填写电影帧数、显微镜电压以及每帧曝光量。

运行该流程以生成加权剂量和未加权剂量的运动校正后平均显微图像。接着，打开 CTER 菜单，选择 CTF 估计，并将未加权剂量的显微图像设置为输入。

命名输出目录，并填写数据采集参数。将最低频率设置为 0285 inverse angstroms，最高频率设置为 0.285 inverse angstroms。运行该过程以生成CTF参数列表。

接下来，打开 WINDOW 菜单，选择粒子挑选（Particle Picking）。将剂量加权的显微照片设为输入，启动 e2boxer 工具。手动或自动进行粒子挑选。

将挑选出的颗粒提取为图像堆栈，并将这些堆栈合并为 BDB 数据库中的一个单一虚拟图像堆栈。颗粒完成挑选并堆叠后，打开 ISAC 菜单并选择 ISAC 二维聚类。将 BDB 数据库中的虚拟图像堆栈设置为输入。

估算每类的图像数量。填写其余参数，并生成二维分类平均图像。二维分类完成后，使用“显示数据”工具查看已验证的可重复分类平均图像。

确认已包含多种颗粒取向，且分类平均图像质量令人满意。生成一个新的虚拟图像堆栈，仅包含属于已验证分类平均图像的颗粒。接着，打开 VIPER 菜单，使用显示数据工具查看分类平均图像。

删除质量较差或显示颗粒相同视角的类别平均图像。将剩余的类别平均图像保存至新文件。然后，选择初始三维模型 RVIPER，并以少量筛选后的类别平均图像作为输入。

运行命令以生成蛋白质的初始可重复三维模型。在分子图形程序 Chimera 中检查该模型。将该模型与目标蛋白质或其结构域的同源蛋白已知结构进行比较。

返回 SPHIRE 中的 VIPER 菜单，选择创建 3D 参考模型。使用正确的像素尺寸和 3D 掩模生成初始 3D 参考模型。打开 MERIDIEN 菜单，选择 3D 精修。

填写输入图像堆栈和初始3D参考文件的路径。为输出目录命名，并将参考模型的掩膜设置为3D掩膜。选择应用硬2D掩膜。

将起始分辨率设置为 20 至 25 埃之间，并进行 3D 精修以生成未过滤的半体积图。随后在 Chimera 中查看未过滤的半体积图。确定一个二值化阈值，使得所有蛋白质密度相互连接，而噪声伪影不相连。

返回 SPHIRE 的 MERIDIEN 菜单，打开自适应 3D 掩模（Adaptive 3D Mask）。输入未滤波的半体积数据和二值化阈值，命名输出掩模，运行程序以生成一个边缘平滑的 3D 掩模。

然后，打开锐化功能，选择两个未滤波的半体积数据。将软边缘半体积三维掩膜设置为用户提供的掩膜。运行该流程，以合并半体积数据，然后对合并后的体积进行滤波和锐化处理。

打开日志文件以查看最终分辨率估计值。生成在3D精细化过程中产生的输入图像堆栈的粒子角分布的3D图。在Chimera中打开经过锐化和滤波的3D模型。

检查密度图及其高分辨率特征。在 Chimera 中打开角分布，验证欧拉角是否呈各向同性分布。打开 SORT3D 菜单，选择 3D 变异性估计。

从属于已验证类别平均值的粒子图像虚拟堆栈生成三维变异性图。根据该变异性图生成二值化的三维掩膜，用于后续的聚焦三维聚类。然后，打开3D聚类RSORT3D，选择前一次三维精修的目录作为输入。

命名输出目录，并设置全局和聚焦的三维掩膜。对于大型数据集，每组至少使用 5,000 至 10,000 张图像。运行分类过程，以生成每个均质三维组的体积结构。

使用 Chimera 鉴定出表观分辨率最高的结构。返回 SPHIRE 中的 SORT3D 菜单，打开局部子集优化功能。将子集文本文件路径设置为对应于最高分辨率结构的粒子 ID 聚类文件。

将3D精修目录设置为包含未过滤半体积数据的目录，并将重启迭代设置为上一次3D精修中最高分辨率的迭代。运行命令以生成局部未过滤的半体积数据。然后，从其中一个局部半体积数据创建一个边缘平滑的3D掩模。

合并局部半体积数据，并在不应用低通滤波的情况下锐化合并后的体积。接着，打开 LOCALRES 菜单，点击局部分辨率，然后选择局部半体积数据。

然后，选择局部软边缘掩膜。将整体分辨率设置为合并局部体积图时估计的绝对分辨率。计算该体积图的局部分辨率。

接下来，打开 3D 局部滤波器。将锐化后的未滤波局部体积作为输入，选择局部分辨率图和软边缘 3D 掩模。

将局部分辨率滤波应用于已锐化的体积数据，以生成最终的三维模型。在 Chimera 中打开生成的体积数据和局部分辨率图。启动 Surface Color 工具，从菜单中选择该体积数据，并选择根据局部分辨率对表面进行着色的选项。

通过冷冻电镜对毒素复合物TcdA1进行成像。所有图像均清晰显示出单颗粒及延伸至优于四埃分辨率的功率谱Thon环。使用e2boxer选取颗粒，随后将其提取为图像堆栈。

通过迭代稳定比对与聚类（ISAC）生成二维分类平均图像。这些分类平均图像被用于通过RVIPER计算出一个可重复的三维模型。该模型与先前解析的TcdA1晶体结构高度一致。

使用MERIDIEN对该模型进行自动3D精修，获得了接近原子分辨率的图谱。3D变异性分析表明，组氨酸标签标记的N端区域、受体结合域以及TcB结合域具有局部柔性。同时进行了局部分辨率计算。

对优化后的模型进行了局部滤波，并应用了对应局部分辨率的彩色标尺，显示出高变异性区域与低分辨率区域之间的拓扑一致性。TcdA1 的最终 3.5 埃分辨率冷冻电镜结构显示了大多数侧链的清晰密度。具有此类细节水平的密度图可进一步用于从头原子模型构建。

采用这种方法，可在数小时或数天内获得接近原子分辨率的结构，且无需事先具备结构信息。在尝试该操作流程时，应仅使用高质量的数据，并检查中间结果。冷冻电镜样品的组成和结构异质性可能是达到接近原子分辨率的限制因素。

观看本视频后，您应该已经对如何使用 SPHIRE 进行冷冻电镜结构解析有了充分的理解。正如您所见，SPHIRE 中包含的聚类分析流程不仅能够帮助您解析目标蛋白的结构，还能用于研究构象动态，从而为复杂分子机制提供关键的机理洞察。