一种用于筛选蛋白水解活性的荧光生成肽切割检测法：在冠状病毒刺突蛋白激活中的应用

该方法有助于回答生物化学领域中的一些关键问题，例如蛋白质的蛋白水解修饰，以及蛋白酶、肽酶及其抑制剂的表征。该技术的主要优势在于，能够快速筛选蛋白酶对肽段的蛋白水解活性，从而反映目标蛋白质的切割位点。本文中的应用旨在研究激活病毒融合的蛋白酶。

肽设计的第一步是从公共数据库（如 NCBI 或病毒病原体数据库）获取目标融合蛋白的序列。选择位于融合肽之前的蛋白酶识别位点，并包含该序列上下游的两到三个氨基酸。在订购肽时，应在肽的末端用荧光共振能量转移（FRET）对进行修饰，即在 N 末端添加 Mca，在 C 末端添加 Dnp。

在检测过程中，Mca 被激发后会发射光能，只要 Mca 与 Dnp 彼此靠近，该光能就会被 Dnp 猝灭。然而，如果发生切割反应，Dnp 将无法猝灭发射光，此时荧光酶标仪即可检测到该信号。根据生产商的建议，通过轻柔地吹打重悬肽段。

例如，用70%乙醇重悬至终浓度为1毫摩尔。如果肽段通过移液无法充分重悬，可将含有肽段和溶剂的离心管置于超声水浴中，直至完全重悬。将肽段分装为每份100微升，置于避光或抗光降解的离心管中，以防止肽段发生漂白降解。

将等分试样于-20摄氏度保存。开始此操作前，先打开酶标仪并等待自检完成。接着，在连接的计算机上打开操作软件，并确保其与酶标仪已建立连接。

打开温度设置，将温度调节至蛋白酶最佳活性所需的温度，本实验中为 30 摄氏度。为设置实验，请点击控制仪器设置，选择动力学模式，然后选择荧光检测。输入 330 纳米的激发波长和 390 纳米的发射波长。

取消自动截止，选择中等/正常灵敏度。设定实验运行时间为一小时，每60秒进行一次测量。在第一次测量前设置5秒混匀，每次测量前设置3秒混匀。

最后，选择需要读取的孔。根据文本方案中所述，为蛋白酶准备相应的测定缓冲液，并将缓冲液置于冰上冷却。将一个实心黑色未处理平底聚苯乙烯96孔板放置在冰上，并在板下方垫一块薄金属板以增强冷却效果和稳定性。

必须使用黑色板作为检测板，以防止相邻孔之间的荧光泄漏。每种肽段每次检测需设置三个技术重复，每个样本总体积为100微升。将适量的检测缓冲液加入检测板的每个孔中。

向每个孔中加入 0.5 µL 蛋白酶。向其中六个孔中加入 0.5 µL 缓冲液以代替相应的蛋白酶。其中三个将作为盲样对照，另外三个将作为肽段对照。

除盲对照孔外，向每个孔中加入5 µL肽溶液，使其终浓度为50 µmol/L。向三个盲对照孔中各加入5 µL缓冲液，代替肽溶液。将酶标板放入荧光酶标仪中，点击开始。

开始数据分析之前，先保存实验文件。点击“导出”，将文件导出为 txt 格式。然后将该 txt 文件导入电子表格中。

通过创建图表开始分析，将每个样本的技术重复的相对荧光单位作为纵轴，时间作为横轴进行作图。选择图表中呈线性范围且最接近荧光信号起始上升阶段的数据范围。将选定的数据绘制在第二个图表上，并添加线性趋势线。

在趋势线选项中，选择在图表上显示方程式。该方程式将显示 V max，其对应于趋势线的斜率。根据三次技术重复实验的结果，计算每个样本的平均 V max 值。

在重复实验两次以获得三个生物学重复后，根据三次独立生物学重复的数据计算标准差。对人源MERS冠状病毒EMC/2012的S2′位点、骆驼来源的双突变株HKU205以及EMC/2012的单突变体进行弗林蛋白酶切割实验的结果显示，EMC/2012肽段被高效切割，而HKU205的S2′肽段几乎未发生切割。EMC/2012 A-S突变的S2′肽段切割显著减少，而EMC/2012 S至I突变的S2′肽段几乎未被切割。

另一项弗林蛋白酶切割实验显示，与人类MERS冠状病毒EMC/2012的S2′位点相比，骆驼来源的摩洛哥213株S2′位点仅发生极轻微的切割。弗林蛋白酶可切割典型的S1/S2肽段（FECV I和4 S1/S2），但不能切割突变的S1/S2肽段（FIPV I Black S1/S2）。类似地，弗林蛋白酶能够切割典型的S2′肽段（FECV II 1683 S2′），但不能切割突变的S2′肽段，包括FECV I和4 S2′、FIPV I Black S2′以及FIPV II 1146 S2′。

通过该实验步骤，可利用目的全长蛋白进行蛋白质印迹分析或氨基荧光检测，以验证蛋白切割情况，或在本例中验证切割是否产生具有融合活性的病毒融合蛋白。