高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

我们已建立了一种针对SARS-CoV-2的平台技术，该技术可适用于其他以刺突蛋白介导的细胞识别和入侵作为细胞病毒感染第一步的病毒。量子点具有高亮度和高稳定性，其表面可进行功能化修饰，用于多种细胞应用。利用该方法，我们能够可视化并定量检测刺突蛋白进入细胞的过程。

配制0.1% BSA：将130微升7.5% BSA加入10毫升成像培养基中混合。进行6.1倍三倍系列稀释时，取14.26微升QD Spike加入285.74微升0.1% BSA中，以配制最高浓度为20纳摩尔的溶液。

然后，将100微升20纳摩尔或QD Spike加入200微升0.1% BSA中，配制第二步稀释的6.67纳摩尔QD Spike。使用多通道移液器从每个孔中完全移除所有用过的培养基，用多通道移液器每孔加入100微升成像培养基洗涤一次，随后吸出100微升成像培养基。每孔重新加入50微升QD Spike溶液，并将培养板置于含5%二氧化碳、37°C的湿润培养箱中孵育3小时。

穿戴防护装备，在无菌生物安全柜内配制4%PFA和0.1%PSA成像介质，使用自动化多通道移液器从每个孔中吸出50微升QD Spike，并向每孔加入100微升4%PFA，以避免孔内液体干燥。室温孵育15分钟，随后用PBS洗涤三次，通过将5 mM的储备液以1:1000比例稀释于PBS中配制深红色核染料，吸除PBS后，每孔重新加入50微升稀释后的核染料。室温孵育30分钟，再用PBS洗涤三次，随后对培养板进行成像，或使用板封膜密封以备后续成像使用。

将培养板置于 4°C 保存。启动成像平台的软件。登录成像平台后，通过选择培养板类型为 96 孔透明底成像板、光学模式为共聚焦、放大倍数为 40 倍水浸物镜、binning 设置为 1，创建新的采集方案。

选择高对比度等数字面部对比模式，以获得轮廓清晰的细胞体。拍摄快照以确认图像窗口中该视野合适，并选择适配的C通道，用于ACE2-GFP细胞系，以观察细胞内ACE2的转运情况。如需创建自定义的量子点（QD）通道，请点击三角形下拉菜单，选择激发波长在405纳米范围、发射波长在608纳米范围的通道，然后选择一个具有较强胞质QD信号的孔，以设定曝光时间、激光功率和Z轴高度位置。

检查默认高度是否能在目标焦平面上获得细胞的清晰图像。内吞斑点的Z轴位置将低于质膜的Z轴位置。选择一个曝光时间，通常在100至300毫秒之间，以获得亮度足够、灰度值至少为背景信号三倍以上的图像。

在20纳摩尔时，灰度值应约为6,000个原子单位，曝光时间为200毫秒，激光功率为80%。通过右键单击使用快照功能在各通道中生成的图像并选择“显示强度”，然后左键单击目标对象或背景，查看该像素的灰度值，并调整激光功率以微调目标对象的强度。保存采集方案，切换至“运行实验”，输入板名称，然后运行实验。

通过荧光显微镜和表达 ACE2-GFP 的细胞系，对量子点和 ACE2 的转位过程进行可视化观察。随后进行图像分割与分析，以提取斑点计数等关键参数。首先，从细胞核标记通道中分割出细胞核，以生成感兴趣区域（ROI）群体。

然后，使用 ACE2-GFP 通道对细胞进行分割，勾画出感兴趣区域（ROI）。最后，从细胞的 ROI 区域中分割出 QD 608 Spike 荧光点，结果显示内化的 QD 与 ACE2 信号表现出强烈的共定位。在 HEK 293T 细胞中，使用六种不同浓度的 QD Spike 进行了浓度响应实验。

确定量子点的光浓度时，量子点的使用浓度可低至2.22 纳摩尔，但建议使用10 纳摩尔或更高的浓度，以确保产生稳定的信号响应。在量子点与蛋白结合过程中，可能会发生蛋白聚集现象。在量子点溶液中可观察到明亮的团块状沉淀物，即为聚集物。在HEK 293T细胞实验中，量子点在加入细胞前与中和抗体在30 微克/微升的起始浓度下共同孵育，这些抗体阻断了量子点的结合与内化过程，导致与仅使用量子点处理的细胞相比，荧光斑点数量减少。

该实验方法还可用于高通量筛选、中和抗体的先导评估，以鉴定可阻断病毒进入的潜在抗病毒药物，并可加以改进以研究新出现的变异株。