提高高粘度微晶挤出效率以用于X射线激光器上的时间分辨串行飞秒晶体学研究

本方案旨在确保在时间分辨序列晶体学实验中经常遇到的问题不会影响数据质量。该方法的一个主要优势是其对不同晶体系统的适应性。高速相机挤出测试还可使我们直接测量挤出的稳定性。

首先，在注射前约30分钟，将50微升基于结晶腺单油酸甘油酯（LCP）的溶液装入100微升注射器中。若需注入真空环境，则在第二个注射器尾部加入5微升MAG 7.9和5微升液体石蜡。将注射器垂直持握，排出注射器中的气泡。

将装有 MAG 7.9 和石蜡的注射器连接至标准注射器接头。轻轻推动推杆，排出接头中的空气，直至接头针尖处可见少量混合物为止。将样品注射器连接到注射器接头，注意避免将空气引入样品中。

通过将样品多次穿过连接器，混合脂质和石蜡。接下来，取20微升预混的LCP加入另一支100微升注射器中。将空注射器从连接器上取下，使用标准注射器连接器将预混的LCP注射器与含有晶体的注射器连接。

然后，将样品通过耦合器处理100次。为使样品进入立方相，加入3 µL单油酸甘油酯并混合50次。重复此操作，直至形成透明相为止，以避免单油酸甘油酯过量。

作为样品刚性和可挤出性的初步测试，将空注射器从注射器连接器上取下，垂直握住注射器，通过连接器挤出少量样品。如果挤出的样品能形成直立的圆柱体，则该样品已准备好进行挤出测试。通过添加更多预混的LCP，将样品总体积调整至100 µL。

将样品注射器和两个空注射器连接至三通注射器连接头。通过将一半样品推入第二个注射器，然后同时将两份半量样品推入第三个注射器，重复此操作至少50次以充分混匀。将含有混合样品的注射器置于体视显微镜下，检查晶体是否分布均匀。

清洗高效液相色谱泵及所有水相管路，以确保流速准确。然后，清洗进样器的液压装置。接下来，打开相机并将其连接至配套软件。

在运行实时视频以提供视觉反馈的同时，将喷嘴尖端置于画面中央，并使用三轴载物台将其调至清晰对焦。将相机的帧率设置为每秒 1,000 帧，然后将分辨率设置为 512 × 512 像素。

曝光时间现已由帧率设定，调节光照强度直至喷嘴可见。重新定位喷嘴尖端，使其在左右方向上居中，并位于画面的上三分之一处。将相机设置为延时拍摄模式。

将间隔设置为30秒，重复次数设置为40次。将触发模式设置为随机，并输入要记录的帧数为1,000。

现在，向储液池中加入 20 微升测试样品，并安装毛细管喷嘴。将装有样品的储液池连接到注射器上。然后，将气体管路连接至喷嘴的接口，并启动气体流动。

随后，同时启动泵和相机记录。监测挤出过程，直至泵的压力在接近预期结束时间时急剧上升。然后，停止记录，关闭泵，并通过打开泄压阀释放系统压力。

随后，使用分析软件打开视频文件，并校准测量工具。在视频中找到一个可在挤出物中清晰识别且可追踪的特征帧，记录该帧的帧号。

接下来，将视频前进到一个相同的特征仍可见但已从上一步位置发生移动的帧，并记录该帧的编号。使用直线测量工具，通过“分析-测量”功能测量该特征起点与终点之间的距离。

对视频的每个片段重复上述步骤数次。最后，绘制数据序列。本方案的理想起始材料是高密度的微晶，这些微晶需被包埋于用于注射器的黏性载体介质中。

蛋白质晶体被用于在质子泵细菌视紫红质上收集时间分辨串行飞秒晶体学（TRSFX）数据，揭示了光子吸收后发生的超快变化。使用三通连接器进行样品制备后，通过肉眼观察注射器中的材料可确认样品的均一性。显微镜图像可进一步确认晶体的密度。

当递送介质呈透明且黏稠时，样品处于立方相。浑浊的混合物可能表明样品处于海绵相或层状相，但并非确凿证据，因为高晶体密度可能会遮蔽LCP的透明度。可通过将注射器活塞远离样品拉动，进行低压测试以识别海绵相。

在喷射测试过程中，样品应挤出一根细长且连续的LCP液柱，其移动速度近乎恒定。若样品以滴落模式流出，则表明其黏度过低。能够形成液柱的样品数据应显示，挤出速度保持在由实验参数决定的最低速度以上。

在使用本方案进行优化后，可在专业设施上收集时间分辨的序列晶体学数据。这将揭示蛋白质在执行其功能时发生的整体构象变化。