微流控芯片用于 原位 晶体X射线衍射与 原位 用于序列晶体学的动态光散射

本实验的主要目标是制备并操作一种用于在室温下进行蛋白质结晶及X射线衍射数据收集的微流控装置。该技术的主要优势在于，芯片内部的结晶过程可最大程度减少对蛋白质晶体的机械扰动。这些X射线透明的芯片易于制备，可直接安装在大多数同步辐射光束线的测角仪上，在收集X射线衍射数据时能高效利用有限的晶体样品。

首先，将X射线芯片设计的主模具置于一个内衬铝箔的10厘米培养皿中。按10:1的比例混合总共约30克的PDMS基液与固化剂，将混合后的PDMS倒入主模具上，厚度达4毫米。将PDMS在真空干燥器中脱气5分钟，并用气流吹除PDMS表面残留的气泡。

将PDMS在70摄氏度的烘箱中固化一小时。然后，轻轻将固化的PDMS模具从母模上剥离。使用解剖刀切除多余的PDMS。

在进行X射线芯片制备之前，应确保工作区域布局合理，以便在环氧树脂模具浇注过程中能够方便地接触所有所需的设备和组件。开始芯片制备时，将双组分环氧树脂的前体物质用乙醇稀释，使乙醇的最终质量浓度达到40%（重量比）。使用涡旋混合器将环氧树脂与乙醇充分混合。

将PDMS模具置于真空干燥器中脱气30分钟，以确保PDMS后续能够吸收环氧树脂中的微小气泡。裁剪一块70毫米×70毫米、厚度为7.5微米的聚酰亚胺薄膜，并将其包裹在一块75毫米×50毫米的玻璃载片上。用胶带将薄膜边缘固定在载片背面，形成一个平整、刚性的聚酰亚胺表面。

将带载玻片的聚酰亚胺膜用氧气等离子体处理20秒。然后，在20摄氏度下，将该膜浸入体积分数为1%的APTS或GPTS水溶液中孵育5分钟。在硅烷化过程中，用小刮刀充分混合环氧树脂前体溶液。

将脱气后的PDMS模具从真空干燥器转移至平坦表面。用加压空气或氮气干燥硅烷化聚酰亚胺薄膜。迅速将树脂混合物滴加到模具上每个微结构处。

将带有载玻片的聚酰亚胺膜背面朝下放置在环氧树脂上，并用力按压载玻片。用塑料膜和金属板覆盖该组件，在金属板上放置重物，以向组件施加最高达1.4 牛顿/平方厘米的压力。

15 分钟后，轻轻将玻璃载玻片从环氧树脂图案化的聚酰亚胺薄膜上分离，并擦拭聚酰亚胺薄膜直至干燥。将塑料薄膜、金属板和重物重新放回其上。在室温下静置让环氧树脂固化一小时。

随后，取下重物、金属板和塑料薄膜。轻轻将带有图案的聚酰亚胺薄膜从PDMS模具上剥离。对带有图案的薄膜进行20秒的等离子处理，并按照前述方法，使用APTS或GPTS对图案化薄膜进行硅烷化处理。

在相同条件下，使用另一种硅烷溶液对原始的聚酰亚胺薄膜进行硅烷化处理。用加压空气将两张薄膜干燥。然后，将一滴去离子水滴加到洁净、干燥、平整的表面上。

在聚酰亚胺薄膜上切割出单个芯片结构，并将带有图案的聚酰亚胺薄膜环氧面朝上放置于水滴上，小心地将薄膜展平至完全平整。将第二片聚酰亚胺薄膜的硅烷化面朝下放置在已图案化的薄膜上。用手从一角到对角轻轻抚平第二片薄膜，以排出气泡并使聚酰亚胺片层粘合在一起。

开始制备通路端口时，从已固化的四毫米厚PDMS平板上切下一足够大的块状物，以覆盖聚酰亚胺X射线芯片上的所有端口，但不得覆盖结晶腔室。对聚酰亚胺芯片和PDMS块进行等离子体处理、硅烷化处理并干燥。将处理后的PDMS块压在芯片的端口区域上。

用塑料膜、干净的玻璃片和金属片覆盖芯片。施加 1.4 newtons per square centimeter 的压力，持续一小时。接着，使用 0.75 毫米的活检打孔器，在芯片设计中标记的位置打出入液口和出液口孔洞。

用聚酰亚胺薄膜电绝缘胶带密封芯片背面。然后，用氟化溶剂将质量分数为9%的透明氟聚合物涂层材料储备液稀释至质量分数为0.45%。将一根27号、5/8英寸长的针头连接到注射器上。

将聚四氟乙烯管套在针头末端。将氟聚合物溶液装入一支一毫升鲁尔锁型注射器中。将管子的另一端连接到X射线芯片的出口。

将氟聚合物溶液注入芯片，直至所有通道充满，然后使用装有空气的注射器去除多余的氟聚合物溶液。将充满溶液的芯片平面向下放置于190摄氏度的加热板上。加热芯片5分钟，以蒸发溶剂，从而在通道内壁形成氟聚合物涂层。

在进行结晶实验之前，使用0.2微米滤膜过滤所选的蛋白质溶液。在20摄氏度条件下，以16,100 ×g离心15分钟，并收集上清液用于结晶实验。开始结晶步骤时，将等体积的蛋白质溶液与其沉淀剂混合。

用注射器吸取约 20 微升该混合物。使用 27 号、5/8 英寸的针头和聚四氟乙烯（PTFE）管将注射器连接到 X 射线芯片的入口。以相同方式将含氟化油的注射器连接到出口。

在显微镜下观察芯片的同时，将结晶溶液通过入口注入具有平行布局的芯片中。注入足量的氟化油，以分隔芯片中的结晶区域。然后，使用回形针或其他细小的塞子封闭入口和出口端口。

将芯片置于适当的结晶条件下保存。现在可通过显微镜或动态光散射测量观察晶体形成。当准备进行数据采集时，使用双面胶带将X射线芯片固定在用于平板测角仪的3D打印适配器上。

将芯片适配器安装在同步辐射光束线的样品台测角仪上。收集并分析衍射数据。采用明场显微镜定量测定聚酰亚胺薄膜芯片结晶腔中水的蒸发速率。

动态光散射可检测载玻片上具有相同几何结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片中甜蛋白晶体的初始成核过程，从而优化结晶条件。从在聚酰亚胺芯片中生长的83个甜蛋白晶体中，每个晶体收集了10张衍射图样，每帧采集时旋转1度。该数据集按帧分为五个子数据集，随后评估了归一化衍射强度随时间的衰减情况。

到第四组数据时，衍射能力已下降至50%以下。子数据集的测量R因子值随时间逐渐增加，表明晶体在数据收集中受到了辐射损伤。这归因于X射线照射过程中产生的自由基降解了同一腔室内邻近的晶体。双锥形的索马甜晶体在X射线芯片中呈现出广泛的取向分布。

正交晶系的葡萄糖异构酶晶体在聚酰亚胺芯片中生长时同样表现出广泛的取向分布。然而，硫氧还蛋白晶体主要分布在xy、xz和yz平面，这可能与其细长的形状有关。总体而言，这些芯片非常坚固，且具有较低的X射线背景。

这使得该制备方法适用于其他X射线成像技术，例如小角X射线散射。该流程可轻松调整以满足您的实验需求。例如，可通过调整每个腔室的尺寸或每块芯片的腔室总数来修改芯片设计。

我们的一个特别关注点是设计一种无需昂贵设备（如专用工具或微流控泵）的工作流程。观看本视频并阅读文稿后，您应能充分理解如何在芯片中进行结晶、如何监测结晶过程，以及如何利用芯片方法记录和分析衍射数据。一旦掌握该技术，便可在约三小时内从PDMS母模批量制备微流控芯片，且无需专用的洁净室环境。