片上结晶与室温大规模连续衍射

本方案展示了在类似芯片的装置上进行蛋白质结晶并收集X射线衍射数据的方法。该装置被称为“晶体上生长晶体”，因为蛋白质晶体生长在单个石英晶体上。当蛋白质晶体在该装置上成功生长后，可在室温下从每个装置上收集数千张衍射图像，且无需触碰蛋白质晶体。

室温下的X射线衍射对于研究涉及多种构象状态的蛋白质功能至关重要。这些具有信息性的蛋白质变化或蛋白质行为在低温晶体学中会被冻结，因而无法检测。该技术可用于研究光诱导的信号传导过程和氧化还原变化。

仅有少数设备能够提供完整且冗余的数据集。开始设备预组装时，需在外环上标注样品标识，包括项目名称、设备编号、结晶条件以及所需日期。

然后将标记好的环形圈倒置放在干净的表面上，并将一片石英晶片放入外圈内。接着，取少量显微镜浸油倒入培养皿中，将垫片浸入油中，确保垫片两面均被充分涂覆。用垫片轻触干净表面，去除多余的油。

然后将涂有油的垫片放在第一片石英晶圆上。使用移液器在第一片石英晶圆上混合蛋白质溶液和结晶缓冲液。混合时尽量避免产生气泡。

结晶溶液的总体积不得超过由垫片尺寸和厚度决定的结晶室最大容量。将第二片石英晶片盖在混合溶液上，溶液会自发铺展开来。

然后轻轻敲击第二片石英晶片的边缘，以帮助油均匀铺展并排出空气。将固定环旋入外环，以固定装置。如有必要，可使用紧固工具。

避免过度拧紧，以免导致精密的石英晶片变形或破裂。将组装好的装置存放在室温下的盒子中，或置于温度可控的培养箱内。数小时或数天后，将结晶装置置于显微镜下，观察晶体生长情况。

如有必要，按照论文中所述优化结晶条件。进行校准时，将一块薄的YAG晶体安装在芯片支架上，然后安装光束挡板。接着，打开Insitux软件，运行指定程序以采集直射光束的X射线荧光图像，其中device为用户自定义的结晶装置名称。

param 是包含设备特定控制参数的文件名。然后通过运行光束轮廓拟合程序来确定直接X射线束的精确位置，其中 burn image 是X射线荧光图像的文件名。对于光学扫描，将结晶装置放入芯片架中，并使用拇指螺丝固定。

然后通过运动学装置将芯片架安装到衍射仪的平移台上。根据蛋白质样品的光敏感性及实验目的，在装置的光学窗口处安装白色或红外光源以采集显微图像。设置完成后，输入光束线上指定的扫描运动命令，运行扫描程序。

然后在用户计算机上运行平铺程序，其中 x 为列的初始值，y 为显微照片异常位移的初始值。该程序将所有显微照片拼接成分辨率为一至三微米像素的全景图像。拼接完成后，输入指定命令以运行晶体识别程序。

该程序执行晶体识别和打靶规划，程序中的关键参数可实现特定晶体的选择和目标规划。移除光源并放置光束挡板，然后运行数据采集程序以进行序列衍射实验。

建议的指令会按照预设的顺序访问规划的拍摄点，从而触发数据采集。每个目标晶体将被移至光束位置。在每个停留点，将按照预定的时间延迟进行X射线曝光，曝光时可选择是否同时进行激光照射。

本研究比较了蒸气扩散法与芯片上批量法的结晶条件。本文展示了芯片上结晶的四个案例研究，以及直接从石英装置获取的代表性数据集。动态晶体学实验通过比较暗处条件下4,352个晶体和光照后8,287个晶体的数据，揭示了远红光光感受蛋白在光照诱导下的结构变化。

原位连续劳厄衍射获得的暗态数据集得到了分辨率更高的电子密度图，从而能够可靠地构建出处于全Z构型的胆绿素发色团模型。光诱导差值图揭示了中心β折叠片中协同运动的存在，表明发色团的吡咯环与多个芳香族残基之间的π-π堆积具有重要作用。该平台被称为Insitux。

该平台的独特优势在于，一旦完成结晶，便无需进行任何晶体操作。为了捕捉蛋白质的运动过程，必须在不同条件下收集大量数据集。而Insitux使得这一目标成为可能，因为它能够在室温下从数千个蛋白质晶体中实现大规模数据采集。

通过这种包含晶体学的新功能，可以在装置内触发对光敏感的系统；如果将晶面-晶面装置转化为流出装置，则可以研究对光惰性的系统。