用于体外增强间充质干细胞/基质细胞成骨分化的电刺激装置的构建与使用

本文展示了如何使用常见的六孔培养板构建一个电刺激装置，以及如何利用该装置刺激间充质干细胞的成骨分化。该装置易于制备且成本低廉，可重复用于多次实验。在本装置中经电刺激预处理后，间充质干细胞可用于改善骨组织工程治疗的效果。

该腔室还可用于研究其他细胞类型以及电敏感性细胞行为，如迁移、增殖、膜电位变化、凋亡和牢固贴附等。在六孔板盖子上，于每个孔的外边缘附近标记并钻出两个直径为1毫米的孔，两孔相距25毫米。接着，将铂丝切成12段，每段长5厘米。

将每段五厘米长的部分手动弯成L形，一端留出3厘米，另一端留出2厘米。然后，将镀银导线剪成两段，每段长35厘米。将铂丝较长的弯曲端插入钻好的孔中，使其从盖子外侧突出1至2毫米。

使用镊子将其弯曲。随后，用超导胶将铂丝固定在盖子的孔中，并静置干燥约六小时。制备阴极时，将从盖子中伸出的六根铂丝的末端全部焊接到一根镀银导线上。

制备阳极时，将剩余的六根铂丝焊接到其他镀银导线上。随后，在每一对阳极-阴极铂电极之间的电路中接入LED，以确认其功能正常。在每个LED下方放置一片黑色绝缘胶带，以防止LED光线照射到培养板中的细胞。

接下来，将导线端子块连接器粘接到六孔板盖的左上角，并将两根镀银导线连接到输入端子上。然后，从另一个六孔板盖的左上角切下一块20毫米×20毫米的方形区域，以容纳第一个盖子上的端子块连接器。将带有电极的第一个盖子与第二个盖子盖合，并用胶带将两者粘贴固定。

将两根标准绝缘铜线的一端连接到导线连接器的输出端子，另一端连接到香蕉插头。按下前面板上的电源开关按钮以开启电源。按下按钮一以激活通道一。

随后，按下按钮四以设置电压。将负载输出设为 2.5 伏。然后按 Enter 键。

在用E干细胞处理细胞的当天，将电极置于70%乙醇溶液中消毒30分钟。然后，在生物安全柜中用紫外光照射干燥额外30分钟。在超净工作台内，将装有电极的盖子盖在含有培养的MSCs的六孔板上，确保电极完全浸没在培养基中。

然后，将含有细胞的六孔板（带盖）转移至培养箱中，并将其导线连接至电源。接着，将电源设置为2.5伏负载输出，对细胞进行E stem处理，持续1小时。刺激结束后，断开电源连接，并从培养箱中取出E stem装置。

在无菌条件下，将装有电极的盖子更换为标准的六孔板盖。随后，将细胞放回培养箱中，过夜培养。用 PBS 清洗电极，然后用 70% 乙醇溶液清洗。

然后，用细砂纸清除电极表面累积的腐蚀产物。连续六天重复进行电刺激处理。在第四天，施加电刺激之前，在无菌条件下，吸出 1.5 毫升培养基，并更换为 1.5 毫升预热的新鲜成骨分化培养基。

连续施加电刺激七天后，将细胞继续培养七天，每三至四天更换一次培养基。处理结束后，在显微镜下观察细胞形态的变化。为评估电刺激对间充质干细胞成骨分化的影响，检测钙沉积、碱性磷酸酶活性以及成骨标志基因的表达水平，具体方法参见其他文献所述。

为了评估100毫伏/毫米电刺激对间充质干细胞成骨分化的影响，对接受电刺激处理3天、7天和14天的细胞以及未处理细胞，在培养第14天时通过分析形态学变化和钙沉积情况进行检测。在接受电刺激处理7天和14天的细胞中，可观察到显著的细胞形态变化和钙沉积。在培养第3、7和14天时，对成骨标志基因表达变化进行了详细分析。

在培养第7天，接受7天电刺激处理的细胞中RunX2的表达显著升高。而Col1a1的表达在经过7天处理并于培养第14天测定时显著升高。骨桥蛋白的表达在电刺激组细胞中于培养第3、7和14天均显著增加。

在所有时间点，对照组细胞均未检测到Osterix表达，而接受电刺激的细胞仅在培养7天和14天时观察到Osterix表达。电刺激装置相对易于构建，但在处理铂金丝以及清洁和灭菌电极时必须格外小心。

在我们的电穿孔室中单独或接种于支架材料上进行电预处理的细胞，可被植入动物模型，以研究电刺激的积极作用在体外持续的情况。该技术为研究电刺激调控细胞功能的机制提供了一种简单而强大的工具。这些知识可应用于再生医学中的细胞研究。