高通量 志贺氏菌特异性杀菌试验

目前，志贺氏菌研究领域缺乏明确定义的检测方法，用于评估通过免疫接种或感染产生的抗体的功能作用。本检测方法为鉴定这些免疫应答以及测量志贺氏菌特异性抗体的杀菌活性提供了一种明确定义的技术方案。该检测方法的主要优势在于，能够对多个样本进行高通量分析。

本方案中所采用的技术可显著减少测定抗体和血清样本直接杀菌活性时的手动操作时间及整体检测时间。首先，将样本置于56摄氏度的温水浴中孵育30分钟，以加热并激活待测样本。取一块检测板，在A至G行的第1至第12列各加入20微升检测缓冲液。在H行的第1和第2列各加入20微升检测缓冲液。将每份待测样本各取30微升，重复一式两份，加入检测板的H行中。

开始对测试样品进行三倍系列稀释时，使用多通道移液器从第3H至12H孔中各移除10微升。将样品转移至G行对应的孔中，并上下吹吸8到10次，充分混匀样品。随后，从这些孔中移除10微升。

转移至F行对应的孔中，用移液器上下吹打8到10次以混匀。继续按此方法进行倍比稀释至A行。混匀A行各孔后，从3A至12A孔中分别移除并弃去10微升，使所有孔中的终体积均为20微升。取出一管冷冻保存的目标菌液，室温下解冻。

然后，根据预先确定的最佳稀释倍数，将细菌稀释于20毫升的检测缓冲液中。使用多通道移液器，向检测板的每个孔中加入10微升稀释后的细菌溶液。

取一管冷冻的幼兔补体和一管冷冻的热灭活BRC。用冷流水将两管样品解冻至室温。然后，将100 µL热灭活BRC与400 µL检测缓冲液混合。

向第一列的所有孔中加入 50 微升该 20% 的热激活 BRC 溶液。将 1 毫升天然 BRC 与 4 毫升检测缓冲液混合。向第二至第十二列的所有孔中加入 50 微升该 20% 的混合液。

将培养板置于板式摇床上，轻轻混匀10至15秒。将检测板放入微生物培养箱中孵育2小时。同时，取下两块LB琼脂平板的盖子，将平板正面朝上放置于生物安全柜中，干燥40至60分钟。

孵育完成后，将检测板转移至湿冰上，孵育10至20分钟以终止反应。使用十二通道移液器混匀H行各孔中的溶液，并将10微升反应混合物点样至LBA板底部。立即倾斜平板，使样点向下迁移约1.5至2厘米。

按照上述方法依次对 G、F 和 E 行进行操作，将菌液点在上一行的上方。将 LBA 平板在室温下孵育，直至溶液被 LBA 平板吸收。然后盖上平板盖，将平板倒置转移至微生物培养箱中，过夜培养。

第二天，向每个 LBA 平板中加入 25 毫升 55 摄氏度的覆盖琼脂，其中含有 100 微克/毫升 TTC 和 0.1% 叠氮化钠。在 37 摄氏度下孵育 2 小时，使存活的细菌呈现红色。然后，使用数码相机拍摄平板照片。

将图像转移至计算机，并按照文中方案所述，使用美国国家标准与技术研究院（NIST）的集成菌落计数软件（Integrated Colony Enumerating software）分析图像。代表性LBA平板显示，在过夜培养及覆盖层添加后已发生显色反应，所有存活菌落均呈红色可见。在前三个稀释度测试的所有样品中，细菌杀灭效果均清晰可见。

随着样品在平板上的稀释倍数增加，血清浓度降低，细菌杀灭能力也随之下降。随后使用 NIST 软件进行微菌落计数。计算每份样品各稀释度的平均 CFU 数，并计算出 50% 杀灭值。

然后将此50%杀灭值应用于每种血清稀释度的平均菌落形成单位（CFU），以确定计算SBA杀菌指数（KI）所需的数值。该方案依赖于在LB琼脂平板上实现一致且均匀的细菌接种。良好的点种技术和平板倾斜操作有助于形成独立的微菌落，从而实现准确的菌落计数。本技术使用活的、具有毒力的志贺菌，操作时需遵循适当的无菌技术和个人防护措施，确保按照生物安全二级（BSL 2）规程安全处理细菌。