半导体测序用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测

本文介绍的方案是一种快速、低成本的基于半导体测序技术的胚胎非整倍体筛查方法。经过优化的模板扩增实验流程以及测序文库构建步骤，使胚胎植入前非整倍体检测（PGTA）具有可重复性、高通量、成本效益高且节省时间的特点。该半导体测序仪的运行时间仅为两到四小时。

将从接收样本到出具报告的周转时间缩短至五天。该方法可提供用于非整倍体筛查、拷贝数变异分析以及单核苷酸多态性检测的基因组测序。由于测序化学原理不同，本方案所制备的文库无法直接在其他测序系统上进行测序。

但使用相同的测序仪，仅采用不同的文库制备方法，即可实现无创产前筛查。本次实验操作由本实验室技术员 Xiangchun Guo 演示。开始测序前，将每个稀释后的文库涡旋混匀，并在小型离心机上短暂离心，每次3秒，共离心4次。

然后，取每个文库五微升，加入无核的1.5毫升离心管中进行混合。涡旋振荡混合文库，并在小型离心机上短暂离心三秒。向两个新的回收管中各加入150微升裂解液。

安装新的回收管、回收装置和扩增板。通过倒置油瓶三次来混匀。确保油和回收溶液的液面高度均至少达到三分之二以上。

将主混合PCR缓冲液涡旋振荡30秒，并在小型离心机上短暂离心3秒。将微球颗粒和混合文库分别涡旋振荡1分钟，并在小型离心机上短暂离心3秒。接下来，向含有2000 µL主混合PCR缓冲液的离心管中加入172 µL无核酸酶水、8 µL混合文库、120 µL酶混合液和100 µL微球颗粒，配制成总体积为2400 µL的连接反应混合液。

将移液器调至 800 微升，通过样品口将连接反应混合物加入反应滤膜中。将油瓶倒置三次，使用 P1000 移液器向反应滤膜中加入 200 微升反应油。选择 Proton 程序，然后选择辅助按钮，根据显示器上的指示确保设备已正确设置。

然后单击“下一步”以启动程序。将100 µL乳液PCR产物样品、130 µL洗涤后的磁珠、300 µL ES洗涤液和300 µL洗脱液加入八联管条中。将八联管条放置到富集系统上。

安装移液枪头和一个新的0.2 mL离心管，并启动程序。在15,500 ×g条件下离心0.2 mL离心管5分钟。弃去上清液，保留10 µL富集产物。

向离心管中加入 200 微升无核酸酶水，通过涡旋振荡混匀。再次离心 0.2 毫升离心管。弃去上清液，保留 10 微升富集产物。

向离心管中加入90微升无核酸酶水，通过涡旋振荡混匀。为制备模板，涡旋振荡阳性对照后短暂离心。取5微升阳性对照加入100微升富集产物中。

涡旋混匀后，在15,500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，保留10微升模板。接着，向模板管中加入20微升测序引物和15微升退火缓冲液。

涡旋振荡离心管，并在小型离心机上短暂离心三秒钟。将离心管放入带加热盖的热循环仪中孵育。然后向离心管中加入10 µL上样缓冲液。

通过上下吹打混匀。用移液器上下吹打55 µL样品使其混匀，并将样品加入芯片的加样孔中。保留使用过的移液器吸头和0.2 mL PCR管。

当部分样本进入芯片后，将芯片放入微型离心机中。检查芯片位置，然后离心10分钟。取500微升杂交缓冲液和500微升无核酸酶水加入1.5毫升离心管中，配制50%杂交缓冲液。

通过将500微升退火缓冲液和500微升100%异丙醇加入一个1.5毫升离心管中，制备冲洗溶液。然后，通过将49微升50%退火缓冲液和1微升发泡溶液加入两个新的1.5毫升离心管中，制备发泡混合液。用移液器将空气吹入其中一份发泡混合液中，产生泡沫后，将120微升泡沫加入上样孔中。

将出口孔中排出的过量液体转移至加样孔中，然后在芯片迷你离心机上离心芯片30秒。对第二种发泡混合物重复此过程。向保存在0.2毫升离心管中的样品加入55微升50%退火缓冲液。

使用保留的吸头进行上下吹打。将55微升退火缓冲液全部加入上样孔中。将芯片放入指定的芯片迷你离心机中，离心30秒。

将100微升冲洗液加入芯片加样孔中，并弃去出口孔中排出的液体。重复此加样步骤一次。向芯片加样孔中加入100微升50%退火缓冲液。

重复此上样步骤，共三次。在新的1.5毫升离心管中加入60微升50%退火缓冲液和6微升测序酶。通过移液器吹打混匀。

将65微升该混合溶液缓慢移液至芯片加样孔中，避免产生气泡。将芯片避光保存，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，立即把芯片装载到测序仪上，然后在屏幕上点击“开始测序运行”以启动测序。

对186个卵裂期胚胎和1135个囊胚期胚胎进行的回顾性统计分析显示，两种样本的全基因组扩增（WGA）成功率均超过95%。卵裂期组测序质控失败率为3.4%，囊胚期组仅为1.9%。除非整倍性分析外，测序数据还可用于其他分析。

例如，拷贝数变异的大小小于五兆碱基，或线粒体DNA分析，具体取决于测序深度和质量。随着拷贝数检测技术的不断改进，研究人员可以进一步探究人类早期胚胎中染色体嵌合现象的未来发展方向。