利用斑马鱼胚胎快速评估化学化合物的毒性

毒性测试流程将由我实验室的高级研究员 Ashok Aspatwar 博士进行演示。我们的方案能够在药物发现的早期阶段识别脱靶效应，并检测化学物质的细微毒性作用，而这些作用可能在细胞培养或其他动物模型中被遗漏。本技术的主要优势在于：快速高效，所需化学品用量极少，且仅需实验室的基本设施。

毒性筛选将有助于我们确定该物质抗结核分枝杆菌的有效研究浓度，并为后续的临床前计算提供依据。该方法利用了对化学物质脱靶效应的深入理解，因此可应用于任何将化学物质毒性作为首要考量的研究领域。此方法非常简单，无需 prior 经验即可由任何人操作。

无经验的人员应仔细规划实验，并仅使用一种化合物。该方法通过观察斑马鱼胚胎发育过程中的表型变化，提供所测试化学物质的毒性效应，从而评估其安全性。实验开始时，将2至5条成年雄性斑马鱼和3至5条成年雌性斑马鱼放入交配缸中过夜。

早晨开启光源，因为繁殖由自动的黑暗和随后的光照周期诱导。为避免对动物造成操作应激，同一批个体在用于繁殖前需静置休息两周。次日中午之前，使用细网筛收集胚胎，并将其转移至含有 E3 胚胎培养基的培养皿中。

将培养皿置于体视显微镜下，检查每批胚胎。辨识出不透明的胚胎，并将其移除，这些为未受精或已死亡的胚胎。将胚胎置于28.5°C的培养箱中过夜培养。

第二天早上，在体视显微镜下观察胚胎，并移除任何不健康或已死亡的胚胎。使用巴斯德吸管小心地将一个胚胎转移至24孔板的每个孔中。确保每个孔中含有足够的E3培养基以浸没胚胎。

从冰箱中取出存放在4摄氏度的抑制剂化合物小瓶。使用分析天平称取适量化合物，并在E3培养基或其它合适的溶剂中为每种化合物配制250微升的100毫摩尔/升储备液。然后，根据化合物在15毫升离心管中的毒性水平，用E3培养基对储备液进行系列稀释。

从每个含有一个受精后天数（DPF）胚胎的孔中，使用巴斯德吸管和1毫升移液器逐行移除E3水。立即将每种储备溶液的稀释液各1毫升，从低浓度到高浓度依次加入24孔板的各孔中。对于对照组，加入E3水或其它相应的溶剂。

用化合物名称及其浓度标记24孔板，并将培养板置于28.5摄氏度的培养箱中。注意通过密封24孔板边缘防止孔内化学试剂的稀释液在培养箱中蒸发。暴露于化学化合物24小时后，使用巴斯德吸管将暴露于各浓度化合物的幼虫转移至含有3%高分子量甲基纤维素的小型培养皿中。

使用金属探针，将其侧向放置。将培养皿置于连接相机的体视显微镜下。拍摄图像，并在实验结束前每天将图像保存至单独的文件夹中。

每天将所有观察结果记录在表格中，可以使用在线表格或打印的纸质表格。对于神经毒性化合物暴露实验，四至五天的斑马鱼幼鱼可能会出现异常的游动模式。若出现此情况，应通过拍摄一段30秒至1分钟的幼鱼视频来记录这些变化。

经过五天的化学物质暴露后，记录每种化学物质的半数致死浓度（LC50），即半数胚胎死亡时的浓度。使用合适的程序，针对所有浓度绘制胚胎死亡率的曲线。在本实验方案中，毒性评估的关键部分是在单次实验中测试一种或多种化学化合物的不同浓度。

对于在幼虫中诱导出任何表型缺陷的化合物，需在暴露于化学物质后1至5天内，每隔24小时记录一次缺陷情况。与对照组相比，在250微摩尔和125微摩尔浓度下用β-CA抑制剂处理的胚胎表现出多种表型缺陷。例如，至第3天仍未孵化的胚胎、身体结构弯曲、卵黄囊未被吸收、心包水肿，以及处理后5天幼虫中耳石囊缺失。

在另一项研究中，经碳酸酐酶抑制剂处理的胚胎表现出耳石囊和鱼鳔的缺失。实验鉴定出一种代表性化合物——碳酸酐酶9，该化合物在500微摩尔浓度下对胚胎发育过程中的表型影响极小或无明显改变。该化合物表现出较高的LC50浓度。

然而，与对照组相比，该化合物在300微摩尔浓度下表现出神经毒性，并在暴露五天后诱导幼虫出现共济失调。高质量的胚胎对于化学物质的毒性筛选至关重要。为获得高质量的胚胎，应选用年轻的成年斑马鱼进行繁殖。

筛选出安全的化合物后，可通过开展相关的体外和体内实验进一步表征其特性。在抗结核药物研发领域，该技术有助于建立在斑马鱼胚胎中抑制海洋分枝杆菌的体内实验。本方案涉及使用的化学品可能对人体具有毒性。

参与实验的人员在处理化学品时应采取适当的防护措施。