利用斑马鱼振动惊吓反应筛选系统评估化学品的毒性

在筛选化学物质的毒性时，当前实验面临的一个挑战是如何在考虑到完整生物体复杂性的同时，快速、高通量地确定其在体内的毒性效应。通过采用一种行为读出方法，监测斑马鱼胚胎对振动刺激的逃避反应，我们的系统能够识别出干扰神经或肌肉功能的化合物。由于死亡的胚胎不会运动，因此我们也能检测到因非特异性毒性导致胚胎死亡的化合物。

我们所介绍的系统构建成本较低，且具有可定制性。该系统易于维护，所有部件均可更换。目前，我们正在PrecisionTox联盟中使用该惊跳反应检测系统，以确定用于组学数据采集的化学化合物剂量。

数据来自五种模式生物及人类细胞系，将用于推导毒性通路和生物标志物，以预测人类毒性。首先，在10厘米的培养皿中，通过自然产卵收集处于卵裂期的胚胎，具体为从二细胞期至八细胞期的胚胎。

从培养皿中移除未受精的卵、碎屑和鳞片以清洁培养皿。每个含有15毫升E3培养基的培养皿中放置60个胚胎。将所有盛有胚胎的培养皿置于已用湿纸巾准备好的加湿环境中。

然后在受精后72小时，于设定为28.5摄氏度的培养箱中孵育。接下来，从-20摄氏度冰箱中取出所需的化学储备溶液，并使其解冻。在玻璃瓶中用E3培养基对每种化学物质进行系列稀释。

观察溶液是否有沉淀产生，如有，则记录，并进一步稀释以达到下一个较高浓度。重复检查并稀释，直至无沉淀产生。然后检测并记录暴露溶液的 pH 值。

如果pH值超出7.0至8.5范围，用盐酸或氢氧化钠调节至7.4。未使用的暴露培养基应按照当地法规进行处理。首先，收集斑马鱼胚胎，并在28.5摄氏度的培养箱中培养至受精后72小时。

同时配制待测化学品至所需浓度。检查受精后72小时的胚胎，移除死亡或未孵化的胚胎。

将10个胚胎放入每个六厘米的组织培养皿中，每个培养皿加入九毫升E3培养基。这些培养皿称为暴露板。用化合物名称、暴露浓度和重复编号标记每个暴露板。

从最低浓度开始，向每块培养板中加入一毫升暴露溶液，并轻轻摇晃培养板。对于溶解度较低的化合物，用暴露溶液完全替换培养基中的10毫升。记录化合物溶液添加到胚胎中的顺序。

然后将培养板置于湿润的孵育盒中，在28.5摄氏度的培养箱内孵育48小时。开始振动惊吓实验时，打开计算机和振动装置。创建一个配置文件的电子表格。

记录每个培养板五个位置的处理信息，包括化合物、浓度和重复次数。打开振动惊跳反应检测套件的通用用户界面（GUI）程序。在GUI程序中选择不同位置，以检查摄像头的移动并观察其响应情况。

从培养箱中取出样品板，将其放入五个指定位置，并让胚胎静置数分钟。在图形用户界面程序中，点击“Record”，新窗口将出现。

在此窗口中，选择先前准备好的配置文件。确认样品描述与每个位置上的样品相符。观察程序激活声脉冲时LED灯亮起的情况。

记录完成后，相机会返回至位置一，软件开始压缩文件。将已测量的样品替换为下一组样品，并按演示进行下一次运行。然后使用筛网从所有已测量的培养板中收集曝光溶液，同时保留胚胎。

开始数据分析时，使用 VirtualDub 或其他视频查看软件打开视频数据。通过视觉观察并记录对声音脉冲产生反应的胚胎数量。在电子表格中记录化合物名称、重复次数、化合物浓度以及不动胚胎的百分比。

使用嵌入 R 脚本的 KNIME 工作流进行基准浓度分析。对未经处理的野生型胚胎在振动刺激下的不活动性进行评估，结果显示其平均不活动性为 14.33%，且在不同产卵批次间存在差异。三卡因对运动能力影响的基准浓度计算表明，在 1% 浓度下运动能力下降，浓度高于 2.5% 时活动完全停止，基准浓度 50 为 164.9 微摩尔。

一个次优的实验示例显示出胚胎反应不一致，提示发育问题可能影响惊吓反应的稳健性。