体内抑制 microRNA 以减少小鼠肿瘤生长

我们在甲状腺癌模型中实施了首个基于微小RNA抑制剂的治疗。这些正在开发的疗法为该疾病的治疗展现了良好的前景。这种采用全身给药途径的原位模型，有助于验证新型基于微小RNA的药物。

尽管我们采用原位模型将人甲状腺癌细胞植入小鼠甲状腺，但这些模型也可用于其他癌症类型的全身性研究。Julia Ramirez-Moya 和 Adrian Acuna 将与 Raquel Arocha Riesco 一起演示该操作流程。Raquel Arocha Riesco 是我们研究所的一名技术人员。

在制备CAL-62人甲状腺癌细胞系不完全培养基后，将1×10⁶个细胞分装于50微升PBS中，于4摄氏度下悬浮，并与等体积的基底膜基质混合。将细胞悬液加入配有27号半英寸针头的1毫升注射器中，于6周龄免疫缺陷裸鼠左侧 flank 皮下注射100微升样品。注射两周后，在1.5毫升离心管中，将antagomiR或对照处理缓冲液加入160微升室温下的体内递送试剂中。

立即涡旋振荡溶液10秒，以确保混合物充分形成复合物。将处理液在50摄氏度下孵育30分钟，随后在微量离心机中短暂离心。然后，用新鲜的PBS将沉淀的处理复合物稀释六倍，并充分混匀。

将200 µL的治疗剂直接全部注入肿瘤内。每周对每只实验动物皮下注射2次，每次50 µL浓度为40 mg/L的D-荧光素底物溶液。确保在异氟烷麻醉后通过脚趾夹捏确认无反应。

将动物放入活体生物发光成像系统的成像室中，根据标准操作流程，使用活体成像软件采集生物发光信号。随后分析肿瘤生长情况，并通过T检验比较两种治疗方案，确定其显著性差异及生长差异。

进行原位甲状腺肿瘤细胞接种时，将一份CAL-62细胞悬浮于5 µL PBS中，并向一只7周龄的裸鼠皮下注射100 µL镇痛剂和100 µL抗生素。确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将其置于解剖显微镜下，并用碘伏消毒颈部。接着，在皮肤上做一个约2厘米的切口，移开唾液腺以暴露颈部。

使用解剖镊和/或剪刀解剖带状肌，暴露气管和甲状腺，然后用10 µL注射器将5 µL肿瘤细胞悬液注射至位于环状软骨侧方的右叶甲状腺。待所有细胞注射完毕后，复位唾液腺，并使用丝线编织、涂层、不可吸收缝线关闭切口。随后在伤口区域涂抹碘伏，将小鼠置于加热毯上并持续监测，直至完全恢复。

在甲状腺内细胞注射后两到三周，按所示方法制备处理溶液，并通过眼后静脉窦注射，将溶液静脉注射至麻醉的荷瘤动物体内。在此代表性实验中，与阴性对照组相比，未注射miR-146B抑制剂的肿瘤经瘤内注射后，其生长受到显著抑制。与对照肿瘤相比，在antagomiR处理的肿瘤中，一些增殖标志物的瘤内表达水平也明显降低。

此外，可通过分析肿瘤中提取的RNA或蛋白质来研究微小RNA靶标的回收情况。综合结果表明，体内抑制特定微小RNA是有效的，并可能被开发用于甲状腺癌的治疗。如在小鼠中建立的甲状腺肿瘤所展示的组织学分析，可对肿瘤周围上皮细胞进行染色，从而揭示肿瘤组织中甲状腺滤泡的结构特征。

值得注意的是，对已形成肿瘤的小鼠静脉注射 microRNA 146B 抑制剂后，与对照组处理的动物相比，肿瘤体积显著减小。此外，在原发性肿瘤中，新发现的 microRNA 146B 靶基因 DICER1 的表达在抗 microRNA 146B 治疗后增加，进一步强调了抑制内源性 microRNA 表达、从而恢复其靶基因功能作为甲状腺癌治疗策略的潜力。该技术及其后续关于脂滴蛋白（lipin）的研究结果，为探索基于非编码 RNA 的新型甲状腺癌治疗方法提供了可能。