一种创新的3D打印插件，旨在实现简便的二维与三维细胞培养

该方案可用于开展多种培养研究，并为探究细胞间的直接通讯提供一种新工具。这种新型装置在建立培养模型时可显著节省时间，且适用于需要或不需要特定包被的不同细胞类型。实际上，3D打印插入件的四个腔室可实现不同细胞类型以单层或三维形式进行共培养，并支持多种组合方式。

3D 打印的插件更耐用、更灵活、可扩展性强，可用于设计生理病理学研究的实验模型，例如免疫学或雄性生殖研究。首先，按照制造商的说明，使用经 70% 乙醇灭菌的刮刀，以 10:1 的比例将试剂盒中提供的食品级硅胶和催化剂两种组分混合。用镊子将插件放置于硅胶混合物上，使混合物均匀分布在插件的底边边缘。

将插入物放入六孔板的孔中，并轻轻按压，确保插入物与孔板紧密接触，以避免细胞培养基泄漏。将板置于37摄氏度环境中，使硅胶固化，持续一小时。固化后，通过将带插入物的板浸入70%乙醇溶液中30分钟至一小时，对其进行灭菌处理。

接下来，用移液器弃去酒精，并将培养板置于细胞培养罩内过夜干燥。为培养毛囊外根鞘角质形成细胞和人皮肤微血管内皮细胞，弃去培养瓶中的培养基，加入5毫升胰蛋白酶以使细胞脱落。将含有毛囊外根鞘角质形成细胞的培养瓶置于37°C、5% CO₂条件下孵育5分钟，将含有人皮肤微血管内皮细胞的培养瓶在室温下孵育5分钟。

在15毫升无菌锥形管中，将含有外根鞘角质形成细胞的胰蛋白酶溶液与5毫升添加了5%FBS和生长因子的间充质干细胞培养基混合，并将人皮肤微血管内皮细胞与5毫升添加了5%FBS和生长因子的内皮细胞培养基混合。在室温下以200 G离心外根鞘角质形成细胞和人皮肤微血管内皮细胞悬液5分钟。弃去上清液后，将细胞分别重悬于2毫升相应的培养基中。

取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝染料混合，将10微升混合液加入计数载玻片的计数室中。将计数载玻片插入细胞计数系统，检测细胞数量和活率。用相应培养基将细胞悬液调整至浓度为每毫升50,000个细胞后，用移液器向各个大 compartment 中加入800微升至1毫升细胞悬液，向各个小 compartment 中加入100至150微升细胞悬液。

将角质形成细胞置于添加了5%FBS和生长因子的间充质干细胞培养基中，将人皮肤微血管内皮细胞置于添加了5%FBS和生长因子的内皮细胞培养基中，分别放入小室及较大的其他隔室中。将细胞培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下，或常规培养条件下，以促进细胞贴壁和/或成熟。使用移液器吸出插入式培养小室各个隔室中的培养基。

然后用1毫升37摄氏度温热的PBS冲洗大孔中的细胞，用200微升冲洗小孔中的细胞。加入3毫升适用于所有细胞类型的共同培养基。将含有共培养细胞的培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中培养24至48小时。

使用胰蛋白酶消化使细胞脱离，进行细胞悬液计数，并通过台盼蓝染色检测细胞活力。在培养24至48小时后，于光学显微镜下观察细胞形态，并对实验过程中不同区域的细胞数量进行计数。实验结束时，首先轻轻旋转将小室从六孔板中取出，然后通过拉扯将硅胶从小室上剥离。

使用常规的细胞培养用洗涤剂和清洁材料清洗插入物。随后，将插入物置于高压灭菌器中灭菌，或浸入70%乙醇溶液中浸泡一小时，以备后续使用。比较了细胞表型和细胞活力，在六孔板的孔中观察到90%的细胞活力，而在用于毛囊外根鞘角质形成细胞的3D打印插入物中观察到91%的细胞活力。

人真皮微血管内皮细胞在六孔板孔中的存活率为85%，而在3D打印插入物中的存活率为86%。3D打印插入物中角质形成细胞与内皮细胞之间的间接细胞通讯显示，当插入物中存在角质形成细胞时，人真皮微血管内皮细胞的增殖在24小时后显著增加1.5倍，48小时后显著增加3.1倍，相较于对照组。然而，外根鞘角质形成细胞的条件培养基在24小时后亦可使人真皮微血管内皮细胞的增殖显著增加1.5倍，48小时后增加2.1倍。

通过3D打印插入式共培养模型，检测了角质形成细胞对人真皮微血管内皮细胞迁移的影响。在对照条件下，内皮细胞迁移并在24小时后覆盖了约44%的伤口区域。在角质形成细胞存在的情况下，观察到人真皮微血管内皮细胞的迁移显著增加，分别在3小时、12小时和24小时后覆盖了伤口区域的43%、67%和99%。

类似地，在毛囊外根鞘条件培养基存在下，人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）的迁移能力增强。确保小室与培养板之间的密封性至关重要，以防止培养基在不同腔室之间发生渗漏。该方法可应用于多种实验，如细胞增殖、迁移、镇静剂形成检测，以及DNA、RNA、蛋白质和其他分析。