硝基肽的分析与鉴定：以血管紧张素II为例

该方法有助于通过化学手段和质谱技术来富集和鉴定硝基化肽段，并解答相关关键科学问题。该技术显著提高了质谱检测硝基化肽段的灵敏度，可应用于体外生化体系以及内源性生物组织。对于硝基化血管紧张素II的脱盐处理，使用1毫升移液器，通过向反相固相萃取（SPE）柱上样端加入500微升甲醇和500微升水，对柱子进行预处理。

当所有水溶液流经色谱柱后，将 410 微升硝基血管紧张素 II 溶液上样至柱中。用 500 微升 5% 甲醇水溶液和 300 微升 80% 甲醇水溶液洗涤色谱柱，以洗脱硝基肽。随后，在室温下使用真空离心浓缩仪以默认设置将洗脱液干燥。

对于伯胺烷基化，将粉末状硝基血管紧张素II溶于100微升100毫摩尔的三乙基铵碳酸氢盐溶液中，并在通风橱内加入400微升4%甲醛溶液，短暂混匀。随后，加入4微升0.6摩尔氰基硼氢化钠溶液，在室温下以每分钟400转的速度振荡反应1小时。孵育结束后，加入16微升1%氨水溶液，在室温下淬灭标记反应5分钟，随后加入8微升甲酸进行酸化。

然后使用新的反相固相萃取柱对溶液进行脱盐，方法如前所述。对于硝基酪氨酸还原为氨基酪氨酸的反应，将二甲基标记的硝基血管紧张素II溶于500 µL PBS中，加入10 µL 1 M连二亚硫酸钠，在室温下孵育1小时。还原反应完成后，黄色溶液将变为澄清。

按照所示方法，将还原后的样品在新的反相固相萃取柱中进行脱盐。进行生物素标记与富集时，将二甲基标记的氨基血管紧张素II溶于500微升PBS缓冲液中，随后加入5微升浓度为40纳摩尔的NHS-S-S-生物素（溶于二甲基亚砜），室温孵育2小时。孵育结束后，加入1微升5%羟胺终止反应，并将500微升新鲜PBS缓冲液加入100微升链霉亲和素琼脂糖微珠中，通过三次离心进行平衡。

最后一次离心后，将100 µL磁珠加入反应体系中，在室温下于旋转摇床中孵育1小时。孵育结束后，每次用500 µL新鲜PBS洗涤体系，共洗涤4次，随后加入400 µL 10 mmol/L二硫苏糖醇，在50 °C下孵育45分钟。孵育结束后，离心柱子，将上清液转移至含有20 µL 0.5 mol/L碘乙酰胺的新离心管中，避光孵育20分钟。

然后，如所示，将溶液在新的反相固相萃取柱中进行脱盐，并用20微升0.1%甲酸溶解干燥的肽段。检测时，将产物上样至配备串联质谱仪的液相色谱仪。使用直接与高分辨质谱仪联用的纳米高压液相色谱系统，以每分钟0.3微升的流速，通过60分钟梯度洗脱分离修饰的血管紧张素II肽段。

在数据依赖型采集模式下，先在质谱仪中设置一次完整的全扫描质谱，随后进行 20 次数据依赖型串联质谱扫描，归一化碰撞能量为 28%。然后打开质谱数据，识别每一步反应产物的峰，以确认化学反应已成功进行。此处可观察到血管紧张素 II 在每次化学修饰前后具有代表性的质谱图。

该化合物的分子量由单一同位素峰的质荷比值表示，表明血管紧张素II在此步骤中的化学修饰已成功实现。此处显示的是通过液相色谱串联质谱检测并表征的最终产物。通过二甲基标记对硝基肽进行定量分析，可通过比较每组中单一同位素峰强度来计算轻链与重链的相对含量，从而实现对不同来源富集硝基肽的定量。

按照该步骤，您可以使用程序搜索工具（例如 SEQUEST 或 pFIND 的最大计数法）来鉴定潜在的硝基肽段。该技术发展之后，为研究特异性硝化位点的生物学功能奠定了基础。