使用自动化免疫基质辅助激光解吸电离（iMALDI）进行肽和蛋白质定量

本自动化免疫-MALDI 检测方法的总体目标是以准确且高灵敏度的方式定量复杂生物流体中的肽段和完整蛋白质。该方法有助于解决定量蛋白质组学领域的关键问题，例如用于诊断或监测患者对治疗反应的蛋白质水平定量。该方法的主要优势在于，能够从复杂的样品中高度敏感且准确地定量蛋白质水平。

该技术能够实现疾病的早期诊断，因为检测中的免疫富集步骤可对丰度较低的蛋白质和肽类生物标志物进行定量分析。尽管该方法可用于研究血浆肾素活性，还可应用于其他与疾病相关的研究，例如对癌症相关蛋白进行定量，以用于预后评估、诊断及治疗管理。开始此操作前，将人血浆样本置于室温水浴中解冻五分钟。

然后，将样品置于冰上，直至完全解冻。接着，手动将每份血浆样品各 200 微升转移至 1.1 毫升深孔板中的不同孔内。在 2 摄氏度、3,000 转/分钟的条件下离心 10 分钟。

然后，使用 Bravo 将 500 飞摩尔每微升的 Ang-1 NAT 标准溶液用鸡卵白蛋白进行系列稀释，制备六种校准品溶液。离心后，将每种校准品各 200 微升加入孔板中，并向样本板中加入 125 微升生成缓冲液。使用自动化液体处理系统，在新的 1.1 毫升深孔板中，将 125 微升血浆上清液或 125 微升鸡卵白蛋白溶液与 25 微升血管紧张素 I 生成缓冲液混合。

现在，将溶液自动转移至96孔板中，每种溶液设三个复孔，每孔加入34微升溶液。然后在37摄氏度下孵育平板三小时。进行抗体与蛋白G磁珠偶联时，首先将78微升预先制备好的磁珠悬液转移至1.5毫升离心管中。

使用磁力架在每次洗涤间沉淀磁珠，用1毫升含25%乙腈的PBSC溶液洗涤磁珠七次，再用1毫升PBSC溶液洗涤三次。洗涤完成后，将磁珠重悬于110微升PBSC溶液中，并加入110微升抗血管紧张素I抗体。通过移液混合磁珠与溶液。

然后，将珠子在室温下孵育一小时，同时以每分钟8转的速度旋转。随后，用一毫升PBSC洗涤珠子三次。然后，将珠子重悬于1100微升PBSC中。

现在，手动将珠溶液转移至96孔板中。然后，使用Bravo将珠分装至同一96孔板中。在血管紧张素I生成反应3小时后，将孵育板置于冰上10分钟，以终止血管紧张素I的生成。使用PBS缓冲液自动将稳定同位素标准肽储备液稀释100倍。

此外，将稳定同位素标准肽溶液自动分装至96孔PCR板中。取10 µL稀释后的肽溶液加入孵育板的每个孔中。将稀释后的肽溶液与血浆样本或鸡卵清蛋白溶液混合。

自动将样品或标准品溶液加入到孵育板中的磁珠溶液中并混匀。孵育一小时后，自动使用5毫摩尔的碳酸氢铵溶液洗涤磁珠三次。每次洗涤后，使用磁铁将磁珠吸附至管底。

最后一次洗涤后，向每个孔中加入 10 微升碳酸氢铵溶液，以重悬磁珠。使用 2,600 微米的点样尺寸，自动将七微升磁珠悬液转移至 MALDI 目标板上。待磁珠干燥后，自动将 2 微升预先制备好的 HCCA 基质溶液从基质孔转移至目标板上的每个样品点。

随后，使用 MALDI-TOF 仪器以正离子反射模式分析样品点。利用仪器配套的厂商专用软件进行内标校准、数据平滑和基线扣除。用于检测血管紧张素 I 的自动化 iMALDI 方法可实现大量样本的高通量分析，日内变异系数低于 10%。此处展示了在人血浆样本中检测血管紧张素 I 所获得的代表性质谱图。

此处展示了采用自动化iMALDI检测法获得的188例患者样本的PRA值与使用临床LC-MS/MS方法获得的PRA值之间的相关性。两种方法的相关系数为0.98，斜率差异可能源于使用了不同的内标物或不同的抗体。本检测的线性范围和精密度如下所示。

掌握该技术后，大约可在五小时内完成操作。进行此操作时，请注意正确调整移液头的位置和液体处理速度。操作完成后，可采用其他方法进一步确认患者是否存在原发性醛固酮增多症，包括口服盐负荷试验或生理盐水输注试验。

自动化的iMALDI技术可实现对生物样本（包括患者样本）中与疾病相关的蛋白质或肽进行特异、准确且高通量的定量筛选。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展基于质谱分析的自动化iMALDI检测，用于蛋白质和肽的定量。请注意，操作生物样本（如人血浆）具有极高危险性，在执行实验过程中必须始终采取必要的安全防护措施。