一种用于从无参考基因组的太平洋牡蛎构建虚拟测序cDNA文库的汇聚策略

我们希望通过该方法解决的关键问题是：如何利用从当地食品市场购买的材料中提取的RNA样品，克隆具有生物技术意义的基因？在此，我们以太平洋牡蛎为例，展示该方法及其潜在的进一步应用。该技术的主要优势在于，无需对牡蛎样品进行传统的基因组或cDNA测序。

相反，将细胞色素c氧化酶亚基I和NADH脱氢酶的序列与公共数据库中太平洋牡蛎的参考序列进行比对，以筛选出亲缘关系最近的样本。从该样本制备的cDNA可直接用于克隆具有生物技术意义的基因，这些基因可通过公共序列信息进行选择。本次实验操作将由南京农业大学糖组学与糖工程研究中心的两名研究生吕永梅和李玉泉进行演示。

为制备牡蛎组织样品，使用灭菌的解剖刀从每只牡蛎标本的大致几何中心切取约100毫克的均质软组织。将样品转移至装有50毫升液氮的研钵中。将速冻的牡蛎组织研磨成细粉。

将每份样本的冷冻组织称取75毫克，放入无菌的1.5毫升离心管中，并加入1毫升硫氰酸胍-苯酚提取试剂。该实验流程中最关键的步骤是RNA提取步骤。为最大限度减少RNA降解，必须尽量缩短从牡蛎组织采集到RNA提取之间的时间。

将样品在 14,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中，加入 200 微升氯仿，在涡旋振荡器上充分混匀 10 至 15 秒，直至混合液变为乳白色。接着，按先前步骤再次离心 15 分钟。

使用200微升移液器，小心转移上层水相至新的1.5毫升离心管中，注意勿扰动中间相。向离心管中加入500微升异丙醇，轻轻颠倒混匀样品。然后将样品置于冰上静置20分钟。

在 14,000 × g 和 4 °C 条件下离心 8 分钟，弃上清液。用 1 毫升 75% 乙醇重悬沉淀，于 14,000 × g 和 4 °C 离心 5 分钟。吸除全部上清液，并重复乙醇洗涤一次。

将沉淀在室温下干燥六分钟。然后，将干燥的RNA沉淀溶解于25 µL经DEPC处理的水中，并将离心管置于冰上。RNA样品需在24小时内使用。

为构建cDNA文库，首先在300微升PCR管中，根据论文所述依次加入各溶液，为每个RNA样本配制反应混合液。向管中加入1微升提取的RNA样本。将混合物置于PCR仪中，在42摄氏度孵育60分钟，随后将温度升至95摄氏度，持续5分钟。

将生成的cDNA文库在-20摄氏度条件下保存，最长可保存12个月。首先，取1 µL生成的cDNA文库加入含有PCR混合液的离心管中，PCR混合液需根据论文所述方法配制。将PCR管放入PCR扩增仪中，按照论文所述程序进行PCR扩增，包括初始变性步骤以及35个PCR循环，每个循环包含退火、延伸和变性步骤。

循环结束后，进行一次终末延伸步骤，持续五分钟。取五微升 PCR 产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测其质量。分别在 759 或 748 个碱基对处观察扩增的 COX1 或 ND 基因，应呈现为单一条带。

为纯化剩余的PCR产物，向每个样品中加入100 µL含有高浓度变性盐的DNA结合缓冲液。短暂涡旋振荡以混匀内容物。将纯化柱放入一个2 mL离心管中。

用移液器将反应混合物转移至柱中。将装有已安装柱子的离心管置于离心机中，在室温下以14,000 × g离心一分钟。弃去两毫升离心管中的滤液后，分别加入700微升和400微升洗涤液W2，每次均在14,000 × g下离心，洗涤两次。

接下来，将1毫升去离子水在金属浴中加热至65摄氏度。将柱子转移至一个新的1.5毫升离心管中，然后用移液器将25微升预热的去离子水加入白色柱膜的中心。室温下静置孵育1分钟，使膜充分浸润。

然后，将含有层析柱的管在室温下于14,000 × g离心1分钟。弃去层析柱，将纯化的PCR产物在-20 °C保存，可保存长达12个月。可选地，COX1或ND反向引物也可用于双向测序。

进行Sanger测序时，使用相应的COX1或ND正向引物。获取测序结果后，利用NCBI核苷酸BLAST在线工具将序列与太平洋牡蛎参考菌株的基因组序列进行比对。采用MgUGD和MgUXS基因各自的正向和反向引物，通过PCR扩增并纯化，操作方法同前。

将纯化的PCR产物与消化缓冲液孵育后，取500纳克pET-30a质粒溶解于1.5毫升离心管中，并加入去离子水至总体积为16微升，以制备预消化的pET-30a载体。然后，向管中加入2微升10倍浓缩的消化缓冲液，以及各1微升含有20单位的限制性内切酶Nde1和Xho1。将混合物在37摄氏度孵育3小时。

随后，加入1 µL的1单位碱性磷酸酶，在37 °C下额外孵育1小时。然后将离心管置于预热至75 °C的金属块加热器中，加热10分钟以灭活碱性磷酸酶。在培养含有MgUGD和MgUXS基因的大肠杆菌BL21细胞后，将菌液转移至2 L摇瓶中的400 mL LB培养基中，并在37 °C、200 rpm条件下置于摇床中培养。

3小时后，在分光光度计上以600纳米波长测定光密度，确保其吸光度达到约0.5。然后将摇床温度降至20摄氏度。加入400微升1摩尔的IPTG，诱导重组蛋白表达3小时。

收集细胞后，在4 °C条件下超声破碎细胞20分钟。在4 °C、14,000 ×g条件下离心20分钟，收集上清液至新管中用于活性检测。活性测定完成后，向MgUXS和MgUGD反应混合物中加入20 µL甲醇和40 µL氯仿以终止反应。

将样品混合物涡旋振荡，并在4°C条件下以14,000 × g离心6分钟。收集每根离心管中的上层水相至新的离心管中，用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析。在本实验中，将一个高度变异样本的COX1和ND基因序列与参考的太平洋牡蛎品系序列进行比对分析。

红色箭头显示参考序列与获得的 cDNA 样本序列之间的核苷酸差异。与参考的太平洋牡蛎品系相比，近缘牡蛎标本的 COX1 和 ND 基因序列表现出较低的分歧度。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）结果表明，cDNA 文库成功用于克隆具有工业相关性的基因 MgUGD 和 MgUXS。

凝胶图像还鉴定了由依次表达和纯化的MgUGD和MgUXS酶促生成的UDP-葡萄糖醛酸和UDP-木糖。该方法不要求参考序列与获得的标记序列之间完全匹配，可使研究人员更有信心地开展无参考基因组牡蛎的研究。原则上，只要近缘参考物种的序列已公开，该方法即可应用于任何无参考基因组的生物样本。

该方法使非专业研究人员能够轻松获取具有潜在生物学重要性的遗传物质，并为更多科研人员利用易于获取但尚未完全鉴定的生物样本开展研究铺平了道路。