以整合型张力传感器实现亚微米分辨率的整合素张力与细胞力成像

这种基于DNA的整合性张力传感器（ITS）能够将力信号在局部转化为荧光信号，从而实现利用荧光显微镜直接成像细胞受力情况。ITS具有高空间分辨率和高灵敏度，其激活阈值可调，可选择性地成像不同水平的整合素张力。

在收到目标定制单链DNA（ssDNA）后，若要将RGD肽与硫醇化ssDNA淬灭剂偶联，首先在约450微升新配制的TCEP溶液中加入100微升0.5摩尔EDTA溶液和400微升水。然后，将10微升TCEP-EDTA溶液加入20微升浓度为1毫摩尔的硫醇化DNA淬灭剂PBS溶液中，在室温下孵育30分钟。为将RGD胺与sulfo-SMCC偶联，将40微升新配制的23毫摩尔sulfo-SMCC溶液加入100微升新配制的11毫摩尔RGD胺溶液中，在室温下孵育20分钟。

将硫醇化ssDNA淬灭剂溶液的全部体积与RGD胺SMCC溶液的全部体积混合，在室温下孵育一小时，以实现RGD胺SMCC与硫醇化ssDNA淬灭剂的偶联。孵育结束后，将溶液转移至4°C环境中过夜保存。次日早晨，按照1:10:25的比例，向巯基偶联的DNA溶液中加入三倍摩尔浓度的氯化钠以及经-20°C预冷的100%乙醇，混匀后于-20°C条件下放置约30分钟。

当DNA沉淀完全后，通过离心收集DNA，并将沉淀重悬于PBS中，随后使用分光光度计测定DNA浓度。对于整合张力传感器（ITS）的合成，将上链与下链DNA溶液按1.1:1的摩尔比混合，在4°C条件下孵育过夜，随后将混合物分装并置于-20°C长期保存。对于ITS的固定化，使用200 µL浓度为0.1 mg/mL的生物素化牛血清白蛋白（BSA-biotin）在4°C条件下对直径为29 mm的玻璃底培养皿进行包被处理，孵育30分钟。

当BSA-生物素在玻璃表面发生物理吸附后，每次用200微升新鲜PBS洗涤培养皿三次，随后加入200微升浓度为每毫升50微克的亲和素蛋白，在4摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，如前所述用PBS洗涤培养皿三次，然后加入200微升0.1微摩尔的ITS，在4摄氏度下继续孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤培养皿三次，最后一次洗涤后将PBS保留在培养皿中，直至进行细胞接种。

为建立鱼类角质细胞培养，使用平头镊子从鱼体上拔取一片鳞片，并轻轻将鳞片内侧朝下按压在未经处理的玻璃底培养皿的孔中，使其内表面与玻璃接触。等待约30秒，使鱼鳞牢固黏附于培养皿的玻璃表面，随后加入1毫米厚的完全Iscove改良Dulbecco培养基覆盖鳞片。然后将鳞片置于黑暗且湿润的容器中，在室温下孵育6至48小时。

为了将角膜细胞接种到ITS表面，将角膜细胞培养皿中的培养基替换为1X细胞解离溶液，在室温下孵育3分钟。孵育结束后，用新鲜的完全培养基替换解离溶液，并通过轻柔吹打使细胞解离。随后，将细胞调整至适宜的浓度，接种于涂有ITS的培养皿中，在室温下孵育30分钟，然后进行成像。

为了在活细胞中进行准实时整合素张力成像，将细胞转移至荧光显微镜的载物台上，并选择40倍或100倍物镜。在成像软件中，将曝光时间设置为1秒，帧间隔设置为20秒，以获取ITS图像的视频。然后，使用合适的图像分析软件，将当前帧的ITS视频减去前一帧，以计算在最新帧间隔内新产生的ITS信号。

新生成的ITS信号代表了在最近一个帧间隔内产生的整合素张力，从而以准实时的方式报告细胞受力情况。此处，整合素张力成像显示在角质形成细胞迁移过程中，两条受力轨迹上均出现了整合素张力的诱导。随后，该力图的分辨率可校准为0.4微米。

高整合素张力集中在运动性鱼类角质细胞的后缘。在非运动细胞中，会形成一种与快速迁移的角质细胞中所观察到的截然不同的特定整合素张力模式。可通过共成像鱼类角质细胞的黏着斑和整合素张力，来评估目标细胞中整合素张力与细胞结构之间的关系。

利用ITS技术，细胞黏附力的观测分辨率和灵敏度可达到与细胞结构成像相当的水平。该技术为研究细胞内力与结构之间的相互作用奠定了基础。