无参考牵引力显微镜平台的构建与应用

牵引力显微镜技术用于测量细胞产生的力学力。本方案简化了牵引力数据的采集与分析流程，使其更易于初学者使用。与现有的无参考标记牵引力显微镜平台相比，该技术的主要优势在于：多光子光刻技术可根据具体的实验需求，快速、简便地重新设计图案化结构。

在构建和实施这种新型无参考牵引力平台的过程中，许多关键步骤通过视觉呈现比仅用文字描述更容易理解。对于基底水凝胶的光聚合，首先将三微升预聚物溶液滴加到一片薄而平整的全氟烷氧基烷烃膜上，然后在预聚物溶液液滴周围放置厚度为150微米的扁平PDMS条带，条带环绕液滴但不与其接触。接着将一块经丙烯酸硅烷化处理的盖玻片置于PDMS之上，使预聚物液滴位于盖玻片中心下方，从而将预聚物液滴压平至与PDMS间隔层相同的厚度。

将夹心状的预聚物溶液暴露于紫外光下约一分钟。当水凝胶完全形成后，小心地将盖玻片从PDMS垫片上分离。使用高性能双面丙烯酸胶带将底部开口的培养皿固定在盖玻片上。

将载有水凝胶的盖玻片粘附到培养皿时需格外小心。若培养皿表面过湿或粘附时压力不足，会导致漏液，从而破坏样品。应向粘附接触面施加适当压力，确保盖玻片、粘合剂与培养皿之间形成完全密封，同时注意避免压裂玻璃。

使用无菌过滤的 PBS 缓冲液冲洗水凝胶。然后将 8 微升 NVP 加入 800 微升用于水凝胶合成的实验室溶液中。要将二值图像转换为数字掩模，请打开 MATLAB，然后打开并运行 runscript。

m MATLAB 脚本。选择要转换的二进制 TIF 文件，并选择一个文件夹以保存该区域的文件。输入所选图像期望的最终尺寸（单位：微米）。

输入图像将被缩放并调整尺寸以匹配这些参数。为了创建单个像素数组，在“感兴趣区域生成器选项”中，取消选中“小区域/单像素”下的“移除”复选框，选中“正方形”复选框，并取消选中“水平分割线”下的“使用”。然后，单击“确定”。“OVL”文件将出现在先前指定的文件夹中。

在显微镜软件中打开文件，并加载在双光子激光扫描光刻过程中控制激光快门的指定区域。以下步骤应在避光条件下进行。在低光照条件下制备定位标记阵列时，将200微升预先配制的NVP实验溶液与20毫克Alexa Fluor 633充分混合，并彻底移除含有水凝胶的培养皿中的PBS缓冲液。

将PEG-633混合物以液滴形式加入水凝胶中，确保完全覆盖基础水凝胶，然后将培养皿装载到显微镜载物台的样品架上。接着盖上培养皿，避光静置至少30分钟，使图案化溶液充分渗入水凝胶。为配置成像用显微镜，请选择适合观察Alexa Fluor 488的激光器和滤光片。

利用 PEG-488 信号定位水凝胶，并阻断探测器对更长发射波长的采集。使用垂直和水平拼接扫描，在 XY 平面中确定水凝胶的中心位置，并将载物台在此位置归零。利用 Z 轴层扫功能中的线扫描定位水凝胶表面，并将焦平面在此位置归零。

通过从 XY 中心向外重复进行线扫描以确定表面位置，并根据需要调节显微镜载物台的调节螺钉，从而使水凝胶表面水平。在显微镜软件工作区中，为光刻创建一个独立的实验文件，将多光子功率设置为 1.8%，扫描速度设置为 6。调整图像帧和像素的大小，使像素尺寸达到每像素 0.1 微米，宽高比为 100:1，并将区域文件加载到区域选项卡中。

使用宏来设定所有待采集的区域，并开启Z轴层扫功能。设置Z轴层间距为3.5 µm，总成像深度为28 µm，共采集9个Z层面。然后使用“位置”（Positions）功能，设定水凝胶上将要进行标志点阵列光刻的具体位置。

当浸泡时间接近30分钟时，每隔5分钟对水凝胶表面进行连续的Z轴层扫线扫描，通过观察表面相对于零点焦平面位置的变化来检测是否发生溶胀。如果在5分钟的时间间隔内表面位置未发生变化，则运行图案化设置，并使用488纳米激光确认在图案化过程中水凝胶表面未发生移动。随后将水凝胶从显微镜上取出，从培养皿中吸除PEG-633溶液，并用无菌过滤的PBS冲洗培养皿。

为了获取细胞和定位标记物的图像，将培养皿放回样品架以定位图案化区域。找到目标细胞，并采集该细胞的透射光或荧光图像。随后，如图所示，采集细胞下方图案化阵列的Z轴层扫图像，并再次采集一组该细胞的透射光或荧光图像。

采集图像堆栈时，所得图像应显示规则排列的特征图案，其强度随图像堆栈内Z轴位置的变化而振荡。tracking.m 脚本提供多种诊断图像，包括荧光基准标记的Z轴投影图，用于评估预处理质量；检测到的质心分布图，按Z轴位置进行颜色编码，用于评估目标检测质量；以及轨迹图，显示在Z方向上连接成列的检测基准标记质心，用于评估目标追踪质量。

DISP 3D.m 脚本为给定图像堆栈中每个检测到的特征列提供强度随 Z 位置变化的图，以评估定位标记强度轮廓的质量。两种 DISP 3D。

m 和 DISP 剪切。m 一起提供在每个笛卡尔坐标维度中测得的位移噪声的直方图，以及位移的插值热图。此外，interp final3D_2。

m 提供使用外包代码计算得到的表面牵引力的热图。在此过程中最需要注意的是，含有 LAP 的溶液对光敏感，应尽可能避免暴露于环境光线下。请注意，NVP 是一种挥发性有机化合物，操作时应始终在化学通风橱中进行。