从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本方案描述了一种将血液和单个核细胞重编程为神经干细胞的方法，可用于治疗帕金森病等神经退行性疾病。该方法为治疗神经退行性疾病提供了自体细胞来源。此外，与诱导性多能干细胞相比，重编程为诱导性神经干细胞并分化为所需细胞类型的周期更短。

诱导性神经干细胞具有良好的增殖能力，可在应用前进行扩增。由于iNSCs可定向分化为不同区域特异性的神经细胞，例如脊髓神经元或运动神经元，该方法有望拓展用于其他神经系统疾病的治疗。整个实验流程耗时较长，各步骤相互关联且至关重要，因此通过可视化演示可了解细胞的形态特征，并获得确保成功获得目标细胞的一些技术要点。

首先，将先前分离的外周静脉血转移至一个50毫升的锥形管中，并加入等体积的无菌杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）进行稀释。在另一个50毫升的锥形管中，准备15毫升无菌的密度梯度介质。将锥形管倾斜至45度角，缓慢而小心地将30毫升稀释后的外周血叠加在密度梯度介质上。

将离心管在室温下以800 × g离心15分钟，离心机刹车设置为关闭状态。吸除上层黄色血浆层并弃去。使用10毫升移液管将含有单个核细胞的白色、浑浊的薄膜层转移至新的50毫升锥形管中。

向含有单个核细胞（MNCs）的离心管中加入 30 毫升 D-PBS，于 4 摄氏度下以 600 × g 离心 10 分钟。弃去上清液后，加入 45 毫升 D-PBS 重悬细胞。将离心管于 4 摄氏度下以 400 × g 离心 10 分钟后，弃去上清液。

用5毫升D-PBS重悬细胞，使用台盼蓝排斥法计数活细胞，保留用于扩增的单个核细胞（MNCs），并将剩余细胞冻存以备后续使用。在第-14天，将MNCs以每毫升200万至300万个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入1.5毫升37摄氏度预热的MNC培养基。于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养2天。

在第-11天，使用无菌移液管收集含有培养基的细胞，并转移至新的15毫升锥形管中。在室温下以250 × g离心5分钟，弃去上清液，然后将细胞重悬于1毫升预热的MNC培养基中。用台盼蓝计数活细胞后，将MNC细胞以每毫升100万个细胞的密度接种于六孔板中的预热MNC培养基中。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三天，并在第-8天和第-4天重复收集细胞、离心及在MNC培养基中接种。本操作中的仙台病毒具有危害性，所有涉及仙台病毒的操作必须在生物安全柜中进行。所有接触过仙台病毒的枪头和试管在丢弃前应使用乙醇或次氯酸钠处理。

在第0天，收集MNC培养基中的细胞，转移至15毫升锥形管中。以200 × g离心5分钟后，吸除上清液，加入1毫升预热的MNC培养基重悬细胞。用台盼蓝计数活细胞，然后用预热的MNC培养基将细胞重悬至每24孔板孔200,000个细胞的浓度。

将从-80摄氏度保存条件下取出的含有仙台病毒的管子在37摄氏度水浴中解冻5至10秒，随后在室温下继续解冻。解冻完成后立即置于冰上。按照感染复数为10的条件，将解冻后的仙台病毒加入含有单个核细胞（MNCs）的24孔板孔中。

为了促进细胞贴壁，将培养板在1,000 × g条件下离心30分钟，随后将培养板置于37°C、5% CO₂的培养箱中。第一天，将细胞连同培养基转移至15 mL离心管中。为进一步分离残留的细胞，用每孔1 mL MNC培养基冲洗孔内，然后将冲洗液连同细胞一并加入该离心管中。

将细胞悬液在200 × g条件下离心5分钟，吸除上清液，用500 µL新鲜预热的MNC培养基重悬细胞，接种至24孔板的一个孔中。第2天，将已稀释的聚-D-赖氨酸（50 µg/µL）用D-PBS稀释后，每孔加入1 mL，用于包被6孔板，室温孵育至少2小时。吸除6孔板中的聚-D-赖氨酸溶液，将板垂直置于洁净工作台中干燥约10分钟。

然后每孔加入1 mL预先稀释的浓度为5 µg/mL的层粘连蛋白，加入至6孔板中，在37°C孵育4至6小时以包被。使用前用D-PBS洗涤平板。第3天，将所有经仙台病毒转导的单个核细胞（MNCs）接种于已包被多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白的6孔板中，使用诱导性神经干细胞培养基进行培养。

在第5天和第7天，向6孔板的每个孔中轻轻加入1毫升37摄氏度预热的iNSC培养基。从第9天到第28天，每天更换新鲜的预热iNSC培养基。观察iNSC克隆的出现情况，约2至3周后，使用烧制的玻璃移液管挑选形态合适的克隆，并将每个克隆转移至6孔板的一个独立孔中进行扩增。

为建立单侧6-羟基多巴胺损毁小鼠模型，需对一只已麻醉的成年雄性SCID-beige小鼠进行头部剃毛，并涂抹红霉素眼膏。将小鼠置于立体定位仪上，用门齿杆固定小鼠，并正确插入耳棒，以确保小鼠头部被稳固且适当地定位。

用聚维酮碘和异丙醇对头部进行消毒，然后使用手术刀片在头部皮肤上做一个约1.5厘米的矢状切口，暴露颅骨。调整门齿杆和耳杆，使前囟与后囟之间的高度差减小至小于0.1毫米。缓慢移动并降低微量注射器针头的尖端，使其接近前囟，并将前囟视为零点。

将针尖移至相对于前囟前0.5毫米、外侧2.1毫米的位置。回撤针尖，用记号笔标记该点，并使用电钻在颅骨上钻出一个小孔。用微量注射器吸取2微升浓度为5微克/毫升的6-羟基多巴胺溶液。

将针头回退至标记位置，插入针头至背侧/腹侧 3.2 毫米处。以每分钟 1 微升的速度从注射器中注入 6-羟基多巴胺溶液，注射完成后将针头留置原位 5 分钟，然后缓慢拔出。缝合切口后，再次在眼睛上涂抹红霉素眼膏。

将小鼠从立体定位仪中取出，放入恢复笼中，并提供食物和水，直至其恢复意识。在PBMNCs被SeV感染后，其形态发生变化，细胞在第5天前经历显著死亡。神经干细胞样克隆（INSC）于第12天出现。

经过多次传代挑选并转移iNSC克隆进行扩增后，这些细胞表现出良好的形态特征，并能够在iNSC培养基中以单层或球状形式稳定地自我更新。经过24天的分化后，iNSCs被鉴定为多巴胺能神经元，因为其中大部分细胞表达了酪氨酸羟化酶、叉头框A2以及神经元特异性III类β-微管蛋白标记物。在建立单侧6-羟基多巴胺损毁的帕金森病小鼠模型后，进行了行为学评估，以评价帕金森病症状。

接受细胞移植的小鼠在运动功能上表现出显著改善。通过死后对纹状体、内侧前脑束和黑质致密部进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光染色，验证了6-羟基多巴胺诱导的损伤程度。在细胞移植的纹状体区域，TH阳性信号显著恢复，在黑质（SN）区域也有轻度恢复。移植后三个月，在存活的细胞中，约13.84%为TH阳性的多巴胺能神经元。

约91.72%的TH阳性细胞表达孤儿核受体，约86.76%表达FOXA2，约98.77%与G蛋白偶联内向整流钾通道共标记。将30 mil的稀释外周血铺在密度梯度介质上时，请缓慢且小心操作，避免扰动梯度界面。应注意避免反复冻融仙台病毒，以确保病毒具有较高的活性。

将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞时，请每天密切观察细胞形态。此外，6-羟基多巴胺对光和温度敏感，注意避光保护溶液，并在使用前置于冰上。

通过该方案，可利用家族性帕金森病患者来源的培养多巴胺能神经元进一步研究疾病机制。也可进一步探究移植细胞对受损神经环路的影响。