利用嗜热菌蛋白酶分离大鼠表皮与真皮以检测部位特异性炎症相关mRNA和蛋白质

本方案是一种简便且经济的表皮-真皮分离技术，用于确定皮肤炎症过程中炎症介质和神经营养因子的部位特异性产生情况。该技术的主要优势在于，表皮与真皮的酶解分离在4°C下进行，可保持mRNA和蛋白质的完整性。该方法有助于深入了解在急性和慢性炎症期间使初级传入神经末梢致敏的介质类型，从而为开发新型治疗干预措施提供依据。

该研究可惠及伤口愈合、皮肤疾病、慢性伤口及烧伤的治疗。此外，该方法还可应用于其他上皮表面，如胃肠道和角膜。不同实验室之间的最佳分离时间可能略有差异。

建议进行一项初步实验，结合不同时间点和二维形态学评估，以确定分离效果的质量。在确认麻醉后的8至9周龄Sprague Dawley大鼠足底反射无反应后，于其右侧无毛后足掌皮下注射100 µL用PBS稀释的1X Lambda-卡拉胶。使用卡尺在注射前即刻以及注射后6小时和12小时测量后足跖部厚度，以确定对刺激产生的水肿体积。

在适当的实验终点，使用锋利的解剖刀从注射侧后肢足垫采集一块大小为1 mm × 2 mm的无毛皮肤组织，用显微解剖镊子将皮肤转移至预冷的微量离心管中，管内含1 mL冰冷的DMEM，置于冰上保存15至60分钟。在组织孵育期间，将1 mL freshly prepared activated thermolysin 加入置于冰上的24孔细胞培养板的10个孔中。孵育结束后，用显微解剖镊子将每份皮肤样本转移至含活化thermolysin的孔中，每孔一份，确保角质层朝上，且样本不浸入溶液中。

必须确保皮肤不浸入嗜热菌蛋白酶中，并且角质层朝上，以实现有效的分离。两到三小时后，用显微解剖镊子将一块皮肤样本浸入培养皿中七至八毫升、4°C的DMEM培养基中，以提供更大空间，使表皮与真皮进一步分离。用镊子轻轻刷拭皮肤边缘周围的表皮，直至在样本边界处观察到接近半透明的表皮。

当表皮明显与真皮分离时，用一把镊子小心夹住每一层皮肤，缓慢将表皮从真皮上剥离，然后通过光学显微镜观察分离后的表皮透明度，以确保其光学特性均匀一致。若分层操作正确，将表皮和真皮组织分别放入含有5毫摩尔EDTA的DMEM溶液容器中，于4摄氏度条件下孵育30分钟。在热蛋白酶失活后，取部分表皮组织置于适当的固定液中，在室温下振荡固定1小时。

孵育结束后，将固定好的组织置于含10%蔗糖的PBS溶液中，室温下振荡孵育1小时，随后将样品包埋于适当的组织包埋介质中并冷冻，以进行切片。使用冷冻切片机切出厚度为14 µm的横切面，并将切片贴附于明胶包被的玻璃载玻片上。在载玻片加热板上干燥后，用甲苯胺蓝工作液染色90秒。

随后，用 PBS 轻轻洗去载玻片上的甲苯胺蓝，使用水性封片剂加盖盖玻片，然后在 50 至 250 倍放大倍数下通过明场显微镜观察表皮。向大鼠后足掌注射角叉菜胶可引起典型的炎症症状，如注射后 6 小时和 12 小时均出现红肿和水肿。明场显微镜可用于评估热蛋白酶分离大鼠无毛后足皮肤表皮与真皮的效果。

事实上，表皮横切面的甲苯胺蓝染色显示，表皮在基底膜处与真皮分离，但表皮的钉突结构以及真皮乳头的凹陷部分仍保持完整。此外，所有角质形成细胞层均清晰可见。在4°C条件下，经热蛋白酶分离的表皮进行蛋白质印迹分析可获得一致的结果，表明该技术处理过程中蛋白质水平稳定。

在正常大鼠表皮中几乎检测不到神经生长因子（NGF）蛋白，但在卡拉胶诱导的炎症发生6小时后，NGF蛋白水平显著上调。注射后12小时，NGF水平较6小时时有所下降，但仍高于对照组。与Western blot分析结果一致，在正常对照组表皮组织样本中未检测到NGF免疫反应性；而在卡拉胶诱导炎症6小时后，颗粒层和透明层的大多数角质形成细胞中均可见NGF免疫反应性。

棘层中也有少量细胞呈神经生长因子免疫反应阳性。使用嗜热菌蛋白酶分离完整表皮时，需注意最佳分离时间必须由最终使用者通过实验确定。可采用多种蛋白质组学和分子生物学技术来验证特定蛋白质和/或初级基因转录本的表达，以确认该操作不会改变基础表达水平。

这种表皮-真皮分离技术将使研究人员能够进一步探究在不同皮肤炎症模型中神经营养因子和炎症介质的部位特异性表达。苦味酸和多聚甲醛具有危险性。操作这两种化学品时应在通风橱中进行，使用个人防护服和手套，并在接触后清洗面部和双手。